馬腺疫鏈球菌新疆株2種新SeM基因型的鑒定及其遺傳變異分析

張 歡，張澤華，呂芬芬，汪 麗，蒲小峰， 張寶江，蘇 艷

(新疆農業大學 動物醫學學院，烏魯木齊 830052)

馬腺疫是一種馬屬動物的常發傳染病[1]，以發熱、上呼吸道黏膜炎癥、下頜淋巴結腫脹化膿為特征[2-3]。該病在世界范圍流行，馬腺疫鏈球菌(Streptococcusequisubsp.equi，S.equi)是引起該病的病原菌，是C群鏈球菌的成員[4]。該病目前仍困擾世界養馬業[5-6]。

seM蛋白是位于S.equi菌體表面一種耐熱耐酸的纖維蛋白，是該菌重要的毒力因子和保護性抗原[7]，能夠與纖維蛋白原及免疫球蛋白IgG結合，抑制吞噬細胞的吞噬功能并參與機體的免疫調理功能[8-9]。由于環境、宿主免疫壓力的影響使seM蛋白的N端不斷變異并表現出序列多樣性，不同地區馬腺疫鏈球菌分離株的seM蛋白N端序列往往會有明顯的差異[10-11]。目前，SeM基因的多樣性已成為對該病進行菌株來源分析及疾病流行病學分析的重要指標[12-13]。SeM基因分型是依據該基因在不同菌株之間的多態性而建立的基因分型方法，不僅可以在全球數據庫中對分離菌株進行比對分析，還可跟蹤分離菌株流行演化特征，有利于對該病的有效防控。

16S rRNA基因具有良好的保守性，16S rRNA基因序列分析已成為細菌分類系統中最有用和最常用的研究工具[14]，也可用于細菌性疫病的分子流行病學研究[15]。新疆馬腺疫頻繁發生，已造成嚴重的經濟損失[16]。本研究對從新疆伊犁地區分離鑒定的2株S.equi(Z422、JMC111)進行生化及藥敏特性檢測，并對菌株進行16S rRNA基因序列分析和SeM基因分型，從全球基因數據庫層面了解和掌握S.equi新疆地方株基因型的特點，以期為新疆地區馬腺疫的有效防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

無菌采集新疆伊犁某馬場發病馬匹的下頜腫脹組織及分泌液，從2個馬場分別采集病樣12份及15份。PCR擴增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。營養肉湯培養基、TH培養基、瓊脂粉、細菌微量生化反應管、藥敏試紙，均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；DL2000 DNA Marker、2×TaqDNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 病原菌的分離培養與染色鏡檢 將無菌采集的病料分別劃線接種至鮮血固體培養基上，37 ℃培養18 h后，挑取疑似單菌落進行純化培養，觀察分離菌的生長狀態并挑取單菌落進行革蘭氏染色。顯微鏡觀察細菌的染色及形態學特征。

1.2.2 生化試驗 將分離菌加入細菌微量生化反應管中37 ℃恒溫培養18～24 h，觀察顏色變化并記錄結果。根據《鏈球菌生化編碼鑒定手冊(GYZ-12St)》對分離菌進行初步鑒定分析。

1.2.3 藥物敏感性試驗 采用紙片擴散法，將分離菌菌液均勻涂布于MH固體培養基表面，將含有抗生素的藥敏片貼放于培養基表面，37 ℃培養18 h后測量抑菌圈直徑，重復3次，記錄數據。依據臨床和實驗室標準化委員會(CLSI)藥敏結果判定標準進行判定。用于檢測的抗生素有21種，包括阿莫西林、氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢噻呋、頭孢西丁、青霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、克拉霉素、多西環素、左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、環丙沙星、磺胺異惡唑、磺胺嘧啶鈉、利福平、克林霉素、土霉素和四環素。

1.2.4 16S rRNA的PCR擴增與分析 挑取分離菌純培養單菌落接種于肉湯培養基，37 ℃培養并收集菌體，采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。用表1引物進行16S rRNA基因的PCR擴增。PCR擴增體系(25 μL)：上、下游引物各1 μL、2×TaqMix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、模板2 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s， 35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經電泳檢測回收后進行測序。測序結果通過Blast與GenBank中馬鏈球菌相關參考序列進行比對，利用DNA Star軟件構建系統發育樹。

1.2.5SeM基因的PCR擴增與分析 基因組DNA提取方法同“1.2.4”。用表1引物進行SeM基因的PCR擴增。PCR擴增體系(25 μL)：上、下游引物各1 μL、TaqDNA聚合酶12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、模板2 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火45 s，72 ℃延伸105 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物經電泳觀察后，將目的條帶回收并測序。SeM基因測序結果在PubMLST-seM數據庫中比對進行SeM基因型的鑒定，與該庫中馬鏈球菌馬亞種其他相關序列進行blast比對分析并構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 分離菌的形態學特征

從病樣中分離到2株疑似菌，分別命名為：Z422和JMC111。2株分離菌在鮮血瓊脂培養基上生長良好，菌落周圍出現透明的溶血圈(圖1)。革蘭氏染色后，顯微鏡下觀察可見藍紫色的單個或鏈狀分布的革蘭氏陽性球菌(圖2)。

圖1 分離菌在鮮血瓊脂培養基上形成的菌落形態Fig.1 Colony morphology of isolated bacteria formed on blood AGAR medium

2.2 生化試驗

將分離菌分別接種于生化反應管，經培養后菌株Z422與JMC111均可發酵吡咯烷酮、精氨酸、甲基丙烯酰基、髓磷脂連接糖、曲美他嗪、蔗糖，不能發酵二苯基膦、七葉苷、葡磷、蕈糖、山梨醇，初步判定分離菌為馬鏈球菌，生化反應結果見表2。

圖2 分離菌革蘭氏染色鏡檢形態(1 000×)Fig.2 Gram staining morphology of isolate(1 000×)

2.3 藥物敏感性分析

藥敏結果顯示(表3)，分離菌Z422對21種抗菌藥物中的7種(阿莫西林、氨芐西林、頭孢呋辛、青霉素、克拉霉素、磺胺嘧啶鈉和四環素)藥物耐藥，對3種(紅霉素、克林霉素和土霉素)中度敏感，對其他藥物均高度敏感。菌株JMC111對21種抗菌藥物中的3種(頭孢呋辛、青霉素、克拉霉素)藥物耐藥，對1種(氨芐西林)中度敏感，對其他藥物高度敏感。

2.4 16S rRNA基因的擴增與序列分析

2株分離菌的16S rRNA基因經PCR擴增后，目的條帶約1 050 bp(圖3)，對PCR產物測序和比對后，顯示分離菌Z422及JMC111與S.equi的同源性為99.9%。將測序結果上傳到GenBank數據庫，獲得序列號分別為：JMC111：MT815606、Z422：MT815607，基于16S rRNA基因的序列比較(圖4)和系統進化樹(圖5)，可將所有比較菌株分為3個群，其中本研究中的兩株分離菌Z422及JMC111歸屬 Ⅰ 群，Ⅱ 群和 Ⅲ 群均為馬鏈球菌獸疫亞種。比較結果還發現，分離菌所在的 Ⅰ 群菌株的16S rRNA基因在V5區具有特征性的序列。

表3 藥敏試驗結果Table 3 Microbial susceptibility test results

2.5 SeM基因的擴增及序列分析

分離菌Z422、JMC111的SeM基因PCR擴增后,目的條帶約1 560 bp(圖6)，測序后在馬鏈球菌SeM基因庫中比對鑒定得到兩個新基因型(圖7)，菌株seM 208(JMC111)和seM 209(Z422)。分離菌與馬鏈球菌馬亞種參考菌株SeM基因型的系統進化樹分析結果顯示，這2株分離自不同馬場的菌株親緣關系較遠。分離株seM 209(Z422)與seM 195、seM 196親緣關系接近。分離株seM 208(JMC111)與seM 112、seM 7親緣關系接近。

對seM 蛋白N端氨基酸分析比較結果(表4)表明，與參考菌株S.equi4047相比，分離菌seM 208(JMC111)在N端第37～143 Aa 間發生2個氨基酸的變異，而分離于不同馬場的seM 209(Z422)在N端第37～143 Aa 間發生6個氨基酸的變異。

M. DL 2000 DNA標準; 1.Z422; 2. JMC111; 3.陰性對照

3 討 論

馬腺疫一直困擾著世界各國馬產業的發展，近年來隨著新疆地區馬養殖業的快速發展，馬腺疫頻繁發生。2011年新疆地區發生的馬腺疫，發病率達到80%～90%，當年生馬駒的發病率高達100%[17]。

目前對S.equi分離株seM進行基因分型和遺傳進化分析已成為研究該病分子流行病學的重要手段。國外對于S.equi分離株進行的分子水平的基因分型和遺傳進化研究較多，國內該方面的信息缺乏，不利于對該病的防控提供流行病學數據。

seM蛋白N端第37位至第183位的變異與該菌對免疫壓力和環境的適應性密切相關。通過對58株S.equi分離株的序列分析發現，21個核苷酸的變異共導致18個氨基酸的取代，這些證據表明seM處于多樣化的選擇壓力[18-19]。本研究通過比較2株分離菌seM蛋白N端的氨基酸序列，發現突變主要發生在第37位～第143位的21個氨基酸中。劉云濤等[20]2015年對新疆地區的5株S.equi流行菌株進行了seM蛋白序列的比較分析，與參考菌株S.equi4047 seM蛋白的N端多變區進行對比，在這些菌株的seM蛋白的N端區第47位～第176位共存在6個氨基酸的變異(Aa 47、52、57、58、62、125)。

與參考菌株比較，分離菌株seM 208(JMC111)在SeM基因的N端第47位～第125位氨基酸位點之間共有2個氨基酸(Aa58、Aa107)的差異，seM 209(Z422)則有6個氨基酸的差異(Aa 52、62、70、81、113、122)，2015與2019年新疆地方流行株seM蛋白的N端可變區氨基酸的變化特點表明這些馬源菌株SeM基因隨著時間發生著多樣性的變化。

研究證明，以編碼SeM蛋白N端多變區的基因為依據進行基因分型和進化分析可為S.equi分子流行研究提供重要的工具[10-12,18-19]。SeM基因分型就是一種根據該基因N端的序列變化對不同的S.equi菌株進行分型的方法，采用該方法可以通過網絡數據庫對世界各地的流行菌株序列進行比較，為研究S.equi菌株在世界范圍內的流行提供公共數據[13]。Ivens等[21]對145株英國2010年的分離株進行了比對分析，共發現了23個不同的基因型，根據遺傳距離的遠近又將其分為4個群：seM 9 group群、seM 6群、seM 8群及seM 3群。John等[22]根據研究結果推測，編碼seM蛋白N端氨基酸的基因不斷變異會導致新的基因型產生，這一區域的變異還可幫助S.equi逃避宿主的非特異性免疫但不會干擾宿主的特異性免疫。

圖4 馬鏈球菌16S rRNA基因序列中V1～V5可變區比對結果Fig.4 Comparison of 16S rRNA gene sequences in V1-V5 region

圖5 根據16S rRNA序列構建的馬鏈球菌系統發育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on sequence of 16S rRNA

M. DL 2000DNA Marker; 1.陰性對照 2. Z422; 3.JMC111

劉云濤等[20]2015年根據seM全基因分析新疆地區流行株的流行特點發現，5株流行株可分為2群，一群與美國流行株親緣關系較近，另外一群顯示出本地流行株的特點。2019年，周婷婷等[23]對2013-2017年分離的10個新疆流行株的SeM基因與國外分離株構建系統進化樹，發現根據SeM基因序列比較這些菌明顯分布于4個群的2個群中，該結果與劉云濤等[20]的研究結果基本一致。本次2019年新疆地方株JMC111和Z422分別鑒定為seM新基因型seM 208和seM 209，這兩株菌在同一時間分別流行于同一地區的2個不同的馬場內，根據本研究建立的seM等位基因系統發育樹，發現seM 208型與2006年英國seM 7基因型流行株親緣關系最近，seM 209型與2020年英國seM 195、seM 196基因型流行株親緣關系較近。該結果表明在該地區同一年中不同馬場流行的菌株由于馬匹流動的不同情況，可同時存在著不同的基因型，該結果可為制定該病的預防措施提供一定的依據。

最近國外學者對埃及阿拉伯馬中的S.equi流行株應用SeM基因型鑒定法進行分析發現，流行的菌株基因型主要有4種：seM 139、seM 140、seM 141及seM 199，通過溯源分析得出seM 139與seM 141中國驢源腺疫流行株基因型一致，seM 140與seM 199與歐洲馬源腺疫流行株基因型一致[24]。

16S rRNA常被用于研究系統發育和各亞種之間的進化關系[25]，隨著信息化的發展，核糖體數據庫不斷完善，已經建立了專門的 16S rRNA數據庫，目前認為16S rRNA序列分析方法在未知細菌的鑒定和細菌的分型等領域具有廣闊的應用前景。鏈球菌的分類可依據3種不同的方法,即溶血性分類法、蘭氏分群法和種名分類法。其中種名分類法主要依據鏈球菌的形態、生理生化特性和16S rRNA序列分析等進行鑒定，是最被認可的一種分類方法。

圖7 分離菌SeM基因與seM數據庫中其他基因型菌株的系統進化樹Fig.7 Phylogenetic tree of isolates and other genotypes of S.equi in seM database

表4 seM蛋白的氨基酸序列比較Table 4 Comparison of amino acid sequence in seM protein

16S rRNA序列中含有可變區和恒定區，不同細菌可變區序列不同。有學者發現將16S rRNA序列分析方法應用到皖南花豬細菌性疫病流行病學調查研究是一種行之有效的方法，對該動物疫病防控具有重要作用[26]。本研究中，應用16S rRNA序列分析方法，發現馬鏈球菌馬亞種和獸疫亞種的分離株具有5個特征的可變區，并可分為3個不同的群，其中Ⅰ群具有特征性的V5區，Ⅱ群具有特征性的V2區。國外學者研究結果證明可通過V2區的序列變化與特征來研究馬鏈球菌獸疫亞種的種內遺傳變化[27-28]。本研究通過對2株分離株與國外分離株16S rRNA可變區的比較發現，可根據V1區的序列差異把Ⅰ群、Ⅱ群與Ⅲ群區別開，根據V2區的變化特征可把Ⅱ群、Ⅲ群與Ⅰ群區別開。本研究還發現V5區表現出特征性序列，該序列為S.equi菌株共同具有的特征，推測這可能為馬亞種菌株的遺傳進化特征之一，對V5區序列特征的發現國內外尚未見報道。

青霉素被認為是治療馬腺疫的首選藥物[5]，本次藥敏試驗結果表明，分離菌對青霉素耐藥，該結果與周婷婷等[23]的研究結果一致。此外本研究還發現兩株分離菌對克拉霉素耐藥，該結果表明本地區的馬腺疫鏈球菌菌株正在對更多的藥物產生耐藥，這將導致對馬腺疫的治療變得更難，因此還應科學合理地使用抗生素，以便更好地治療該病。