超濾離心法對CVB-D 脂質體分離及包封率測定的效果分析

陳俊杰

（廣州中醫藥大學第二附屬醫院藥學部制劑科 廣東 廣州 510000）

CVB-D 是從黃楊科植物小葉黃楊及同屬植物經酸性醇提、堿化、萃取、重結晶所得的甾體生物堿，也稱環維黃楊星D 環常綠黃楊堿D、黃楊寧、黃楊堿等，有抗心律失常、抗心肌缺血、舒張血管、降血壓等生理活性，臨床用于治療冠心病、心絞痛、心律失常、心肌缺血等疾病。其分子式為CHN，是一種白色針狀結晶，結構式見圖1。中國藥典（2000 版）采用非水滴定法測定CVB-D 含量，但此方法測定樣品中總生物堿含量，缺乏專屬性。

圖1 CVB-D 結構式

脂質體是一種人工合成膜。磷脂分子親水頭端插入水中，親水尾端伸向空氣，混合攪拌后形成類脂質雙分子層結構的球狀脂質體。脂質體具有類似細胞膜的特點，可使藥物遞送到細胞內部。脂質體具有可包封難溶性藥物、毒性小、生物相容性高等特點發展迅速。脂質體的質量評價包括形態、粒徑、包封率、載藥量和穩定性等，而包封率是篩選脂質體制備工藝和評價其質量的重要指標，對提高藥物治療作用、減輕藥物不良反應以及降低藥物劑量作用極大。在《中國藥典（2010 版）》中，脂質體制劑指導原則中規定脂質體包封率不得小于80%。包封率的檢測需分別測定脂質體藥物總含量和脂質體外的游離藥物含量，然后再通過公式得出包封率，而分離脂質體與游離藥物的方法通常有采用柱層析法、超濾離心法、透析法、魚精蛋白沉淀法、熒光法等。

本研究旨在采用超濾離心法從脂質體中分離出游離CVB-D 后，利用UPLC-MS/MS 測定CVB-D 含量，從而計算脂質體包封率。由于超濾離心法的離心速度和時間對超濾離心管洗脫能力影響較大，所以本實驗先建立UPLCMS/MS 測定CVB-D 方法，再對離心速度和時間進行考察以確定超濾離心法的離心條件。

1.儀器與材料

1260-6460 三重四極桿液質聯用儀（美國安捷倫公司），TLE204/02 萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器〈上海〉有限公司），超濾離心管（0.5 mL 10 KD，美國密理博公司），5 427 R 臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf 股份公司），微孔濾膜（天津津騰實驗設備有限公司），CVB-D 對照品（批號161217，成都瑞芬思生物科技有限公司），甲醇（色譜純，德國Merk 公司），乙腈（色譜純，德國Merk 公司）甲酸銨（質譜純，德國CNW 科技公司），其他試劑（分析純，市售），水為自制超純水。

2.方法與結果

2.1 UPLC-MS/MS 測定CVB-D 方法的建立

2.1.1 對照品制備 CVB-D 對照品溶液：精密稱取CVB-D 對照品10.0 mg 置于100 mL 量瓶甲醇定容，即得到0.100 mg/mL 的CVB-D 對照品溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Waters Xterra MS C18（2.1×50 mm 3.5 μm）；流動相：乙腈（A）- 含0.01 mol/L 甲酸銨的0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫程序（見表1）；流速：0.35 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL，檢測離子對為m/z403.4 →372.1。

表1 梯度洗脫程序

2.1.3 線性關系考察 精密量取CVB-D 對照品溶液以甲醇定容配制成1 μL/mL、2 μL/mL、8 μL/mL、10 μL/mL、20 μL/mL、50 μL/mL，在上述建立的色譜質譜條件下進行檢測。以色譜峰面積為縱坐標與樣品濃度為橫坐標進行線性回歸（= 6），說明樣品濃度在100 ～5 000 ng/mL 之間呈良好線性關系。結果見圖2。

圖2 UPLC-MS 測定CVB-D 標準曲線

2.1.4 專屬性檢驗 分別取CVB-D 對照品溶液、空白脂質體各100 μL 混勻后以甲醇稀釋至10 mL，再取CVB-D 對照品溶液100 μL 稀釋至10 mL，分別在上述建立的色譜質譜條件下進行檢測。CVB-D 特征峰的保留時間約3.8 min，無干擾且峰形良好，說明本方法具有較好的專屬性，見圖3。

圖3 CVB-D 專屬性試驗

2.1.5 精密度考察 精密吸取對照品溶液1 000 μL置于10 mL 量瓶，甲醇定容，在2.1.2 下色譜質譜條件下連續進行5 次檢測，記錄CVB-D 的峰面積。結果見表2。說明儀器精密度符合要求。

表2 UPLC-MS 測定CVB-D 精密度考察

2.1.6 穩定性考察 使用移液槍吸取對照品溶液100 μL 置于10 mL 量瓶，甲醇定容，在10 mL 色譜質譜條件下，以首次測定時間點為0 h，在首次測定后的3 h，6 h，12 h，24 h 后進行質譜檢測，記錄CVB-D 的峰面積。結果表明，CVB-D 在此方法下24 h 內含量基本不變。

2.1.7 加樣回收試驗 精密吸取20 μL，100 μL，200 μL 對照品溶液置于10 mL 量瓶，甲醇定容，每個樣品平行操作3 份。按照上述建立的色譜質譜條件，測定CVB-D 的峰面積，結果見表3，發現UPLC-MS 測定CVB-D的加樣回收率符合樣品的分析要求。

表3 UPLC-MS 測定CVB-D 加樣回收試驗

2.2 超濾離心法測定脂質體包封率方法的建立

2.2.1 CVB-D 脂質體的制備

精密稱量CVB-D 10 mg，大豆卵磷脂100 mg，膽固醇20 mg，維生素E 10 mg，十八胺10 mg，以5 mL 無水乙醇超聲溶解，減壓旋蒸30 min，加入純化水繼續旋蒸水化1 h，探頭超聲3 s 停3 s 3 min 后，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.2.2破乳劑的選擇 分別取0.1 mL CVB-D脂質體，分別加入1 mL 甲醇，無水乙醇，乙腈，10%曲拉通，5%SDS，再超聲5 min，觀察后，加入無水乙醇，10%曲拉通，5%SDS 的樣品出現渾濁，表明破乳不完全，并將澄清的甲醇、乙腈破乳脂質體樣品過0.22 μm 微孔濾膜，按2.1.2 項下質譜條件測定峰面積。結果發現，被甲醇破乳后的樣品質譜峰面積最高。故本實驗選取甲醇作為破乳劑。

2.2.3 超濾離心轉速的考察 取0.5 mL CVB-D脂質體加入超濾離心管中，分別以2 500 r/min、3 000 r/min、3 500 r/min、4 000 r/min 的轉速離心30 min。濾液過0.22 μm 微孔濾膜，按2.1.2 項下質譜條件進行測定，結果見表4，發現離心轉速為4 000 r/min 時，峰面積最大，因此選擇4 000 r/min 進行下面的實驗。

表4 超濾離心轉速的考察

2.2.4 超濾離心時間的考察 取0.5 mL CVB-D 脂質體置于超濾離心管中，在轉速為4 000 r/min 分別離心20、30、40 min。濾液過0.22 μm 微孔濾膜，按2.1.2 項下質譜條件測定峰面積。

結果發現離心時間為40 min 時，峰面積最大，但濾液出現渾濁，表明因離心時間過長而使脂質體破裂。故后續實驗選取30 min 作為離心時間。

2.2.5 超濾加樣回收率 取1 mL 1 mg/mL CVB-D 溶液置于10 mL 量瓶以甲醇定容，取溶液0.5 mL、2 mL、4 mL以空白脂質體溶液定容至10 mL，取0.5 mL 于超濾管中以4 000 r/min 離心30 min。取1 mL 濾液在2.1.2 項下質譜條件測定CVB-D 含量，計算包封率，結果見表5，結果顯示，此方法測定CVB-D 脂質體符合定量分析要求。

表5 CVB-D 加樣回收率

2.3 結果

從上述實驗結果可知采用流動相為乙腈-含0.1%甲酸的0.01 mol/L 甲酸銨溶液進行梯度洗脫程序測定CVB-D 的含量，在樣品濃度為100 ～5 000 ng/mL 呈良好線性關系，符合其他方法選考察指標。超濾離心法條件為轉速4 000 r/min 離心時間30 min。包封率的測定方法為：取0.5 mL 樣品脂質體加入超濾離心管，以4 000 r/min 離心30 min，取濾液以甲醇稀釋10 倍，以UPLC-MS 測定游離藥物濃度C 游。另取0.1 mL 樣品加甲醇定容至10 mL超聲5 min破乳，以UPLC-MS測定濃度C總，以下列公式計算包封率：

3.討論

由于CVB-D結構中不含可被紫外檢測器檢測的雙鍵，《中國藥典（2015 版）》中采用的酸性染料比色法通過紫外-可見分光光度法進行含量測定，也有文獻報道采用蒸發光散射檢測器（ELSD）檢測CVB-D 的含量。其中，酸性染料比色法的專屬性較低，而蒸發光散射檢測器對儀器要求特殊。若使用HPLC-UV 法測定含量，通常使用柱前衍生化法使CVB-D 發生反應，從而衍生出雙鍵可被紫外檢測器檢測，但衍生化試劑毒性大，衍生化容易使樣品中其他成分反應影響CVB-D 檢測結果。超濾離心法操作簡單，用時短，但是耗材成本高，使用中也要注意大分子物質在離心力的作用下在濾膜表面聚集，形成濃差極化層，小分子物質難以透過，使濾膜的滲流量下降，分離效率降低。故需在測定前確定離心轉速與時間。

綜上所述，超濾離心法操作簡便、重復性好，可以達到將脂質體與游離藥物很好的分離的目的，用作CVB-D脂質體的分離并測定包封率。