結腸癌患者血清miR-125b 和miR-18b 的表達及臨床意義

苗金魚 何麗彩 劉 媛 王春艷 王敬然 丁秋蕾

1.石家莊市人民醫院檢驗科，河北石家莊 050000；2.河北省優撫醫院外一科，河北石家莊 050000；3.石家莊市人民醫院腫瘤科，河北石家莊 050000

結腸癌是我國第二大癌癥，2020 年我國新確診結直腸癌患者55.5 萬例，死亡28.6 萬例，分別占我國全部癌癥的12.2%和9.5%[1]。近年來，早期結腸癌檢出率有所上升，但標準藥物治療仍存在局限，中晚期結腸癌患者生存率仍然較低[2-3]。及時判斷結腸癌患者預后對早期采取相應措施和延長生存時間意義重大。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種小RNA 分子，通過調控靶基因表達參與腫瘤的發生發展[4]。近年研究報道，miR-125b、miR-18b 在結腸癌細胞中表達上調，與細胞增殖、侵襲、遷移有關[5-6]。但關于二者在外周血循環中表達與結腸癌預后的關系尚無研究報道，本研究就此進行分析，以期為結腸癌診治和預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年1 月至2016 年8 月石家莊市人民醫院（以下簡稱“我院”）收治的134 例結腸癌患者為結腸癌組，其中男71 例，女63 例；年齡41～78 歲，平均（60.54±12.54）歲；腫瘤直徑：52 例≥5 cm，82 例＜5 cm；分化程度：低分化28 例，中高分化106 例；TNM分期[7]：Ⅰ～Ⅱ期87 例，Ⅲ～Ⅳ期47 例；淋巴結轉移35 例。納入標準：①經病理檢查確診為結腸癌；②初診，未接受任何抗腫瘤治療；③患者及家屬知情并簽署同意書。排除標準：①合并腸道感染性疾病、潰瘍性結腸炎等其他腸道疾病或其他部位惡性腫瘤；②免疫和血液系統疾病。另選取同期我院70 名體檢健康者為對照組，其中男37 名，女33 名；年齡26～78 歲，平均（60.68±11.57）歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 檢測方法

采集患者入院后次日清晨和對照組體檢時空腹靜脈血，3000 r/min 離心10 min（離心半徑為10 cm），分離血清于-80℃冰箱中保存待測。TRIzol 試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號：2014007）提取血清總RNA，Takara 試劑盒（北京寶日醫生物技術有限公司，批號：20140844）轉錄合成cDNA，Narodrop 驗證cDNA 濃度及純度，使吸光度（optical density，OD）260/OD280為1.8～2.0，使用伯樂CFX96 qRT-PCR 儀和qRT-PCR 試劑盒（廣州市銳博生物科技有限公司，批號：20142522）進行擴增。miR-125b 正向引物：5’-TAAGGACAAAACGGGACTGG-3’，反向引物：5’-CCTCTTGCCACTTGCTTTTC-3’；miR-18b 正向引物：5’-CTCGCTACGCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-ACGCTFCACGAATTTGCGAT-3’。反應體系（20 μl）：1 μl cDNR、1 μl上游引物、2μl上游引物、10μl SYBR Green Master Mix、6 μl ddH2O；反應條件：95℃30 s（1 個循環）、95℃15 s、62℃30 s、72℃20 s（40 個循環）。以U6（正向引物：5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’，反向引物：5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’）作為內參校正。2-ΔΔCt法計算血清miR-125b、miR-18b 相對表達量。

1.3 隨訪

以患者出院日為起點，通過門診或電話隨訪5 年，隨訪截至2021 年8 月，記錄患者生存情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析，服從正態分布的計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用t 檢驗；計數資料用例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗；K-M 法繪制不同miR-125b、miR-18b 表達結腸癌患者生存曲線，組間比較采用log-rank 檢驗；受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清miR-125b、miR-18b 表達對結腸癌預后不良的預測價值，曲線下面積（area under the curve，AUC）比較采用Z 檢驗。以P <0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-125b、miR-18b 表達水平比較

結腸癌組血清miR-125b、miR-18b 表達為（0.828±0.201）、（1.205±0.166），對照組為（1.442±0.305）、（0.617±0.131）。結腸癌組血清miR-125b 表達水平低于對照組，miR-18b 表達水平高于對照組（t=15.194、25.749，P ＜0.001）。

2.2 臨床病理特征與血清miR-125b、miR-18b 表達的關系

不同TNM 分期、淋巴結轉移患者血清miR-125b和miR-18b 表達比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）。不同性別、年齡、腫瘤直徑、分化程度患者血清miR-125b 和miR-18b 表達比較，差異無統計學意義（P ＞0.05）。見表1。

表1 臨床病理特征與血清miR-125b、miR-18b 表達的關系（）

表1 臨床病理特征與血清miR-125b、miR-18b 表達的關系（）

2.3 血清miR-125b、miR-18b 表達與結腸癌患者生存率的關系

隨訪3～60 個月，中位時間36.50（17.75，49.00）個月，134 例結腸癌患者死亡52 例，總生存率為61.19%（82/134）。以血清miR-125b、miR-18b 表達均值為基準分為高低表達組，miR-125b 高表達組總生存率為77.61%（52/67），中位生存期為38.00（21.00，52.00）個月；低表達組總生存率為44.78%（30/67），中位生存期為33.00（16.00，45.00）個月。miR-18b 高表達組總生存率為41.79%（28/61），中位生存期為33.00（16.50，44.50）個月；低表達組總生存率為73.97%（54/73），中位生存期為38.00（20.50，51.50）個月。K-M 曲線顯示，miR-125b 高表達組總生存率高于miR-125b 低表達組（log-rank χ2=15.601，P ＜0.001）；miR-18b 高表達組總生存率低于miR-18b 低表達組（log-rank χ2=12.047，P ＜0.001）。見圖1。

圖1 不同血清miR-125b、miR-18b 表達結腸癌患者生存曲線

2.4 血清miR-125b、miR-18b 表達對結腸癌預后不良的預測價值

ROC 曲線顯示，血清miR-125b 與miR-18b 聯合預測結腸癌預后不良的AUC 值大于miR-125b、miR-18b 單獨預測（P ＜0.05）。見表2、圖2。

圖2 血清miR-125b、miR-18b 表達預測結腸癌預后不良的ROC 曲線

表2 血清miR-125b、miR-18b 表達對結腸癌預后不良的預測價值

3 討論

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，大多患者確診時已為晚期，失去手術根治時機[8-9]。盡管近年術后化療、放療、靶向治療等手段取得一定效果，但結腸癌細胞增殖能力和耐藥性強，超過1/3 的結腸癌患者在術后會發生局部復發或遠處轉移，轉移性患者5 年生存率僅為10%[10]。

表觀遺傳學在腫瘤中發揮重要作用[11]。miRNA 是表觀遺傳學的重要一環，可通過降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA 的蛋白質翻譯調控靶基因的表達，與腫瘤發生發展密切相關[12-13]。如miR-101 能靶向Zeste 同源物2 抑制結腸癌細胞遷移[14]，miR-200c能靶向程序性死亡蛋白配體1 基因抑制結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲[15]。miR-125b 的兩個前體為miR-125b-1 和miR-125b-2，分別位于染色體11q24.1 和21q21.1。早期研究發現，其在多種惡性腫瘤中異常表達，如許偉先等[16]研究報道，上調胰腺癌細胞和組織中miR-125b 表達，能抑制胰腺癌細胞增殖和遷移。洪理泉等[17]研究報道，乳腺癌細胞中miR-125b 表達下調，能靶向結合ETV63’UTR 調控Hs578T 細胞，抑制乳腺癌細胞增殖和遷移。提示miR-125b 在不同腫瘤中發揮不同作用。本研究結果顯示，結腸癌患者血清miR-125b 表達降低，且與TNM 分期、淋巴結轉移有關，提示miR-125b 低表達導致結腸癌惡性進展。其機制可能與miR-125b 靶向抑制髓細胞白血病基因-1（myeloid cell leukemin-1，Mcl-1）和信號轉導和轉錄激活因子3（signal transduction and transcription activator 3，STAT3）有關。Mcl-1 是一種凋亡調控基因，能通過維持線粒體膜穩定，抑制細胞色素C 釋放，阻止癌細胞凋亡[18]。STAT3 為細胞信號和轉錄激活的重要激活因子，能通過激活Janus 激酶/STAT 信號通路，參與細胞增殖、分化[19]。研究表明，上調miR-125b 表達能靶向抑制Mcl-1 和STAT3 表達，進而抑制結腸癌細胞增殖、侵襲及促進凋亡[5,20]。通過繪制結腸癌患者5 年生存曲線發現，miR-125b 高表達組5 年總生存率顯著升高，提示miR-125b 低表達與結腸癌患者預后不良有關，可能成為預后分子標志物。

miR-18b 位于染色體Xq26.2，早期研究多報道其與氧化應激的關系[21]。miR-18b 在胃癌細胞和組織中表達上調，能靶向Kruppel 樣因子6 促進胃癌細胞增殖和侵襲[22]。Yang 等[23]研究顯示，miR-18b 在肝癌細胞中表達下調，能靶向核仁紡錘體相關蛋白-1 抑制肝癌細胞增殖。說明miR-18b 也在不同腫瘤中發揮不同作用。本研究結果顯示，結腸癌患者血清miR-18b 表達升高，且與TNM 分期、淋巴結轉移有關，提示miR-18b 高表達導致結腸癌惡性進展，其機制可能與miR-18b 能靶向上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2B（cyclin dependent kinase 2 inhibitor B，CDK2B）有關。CDK2B 是一種促癌基因，位于多種腫瘤中經常突變和缺失的區域，促進癌細胞生長和周期進展[24-25]。研究報道，沉默miR-18b 表達能抑制CDK2B 表達，抑制結腸癌細胞增殖和遷移[6]。進一步分析發現，miR-18b 高表達組5 年總生存率顯著降低，說明miR-18b 高表達與結腸癌患者預后不良有關，可能成為預后分子標志物。ROC 曲線結果顯示，血清miR-125b、miR-18b 均能作為結腸癌預后不良指標，且兩指標聯合預測結腸癌預后不良的AUC 較單獨預測顯著增加，提示聯合檢測血清miR-125b、miR-18b 能提升對結腸癌預后不良預測價值。

綜上所述，結腸癌患者血清miR-125b 表達降低，miR-18b 表達升高，與TNM 分期和淋巴結轉移相關，可作為預后不良預測指標。但本研究結果還需多中心大樣本研究進一步驗證，并深入研究miR-125b、miR-18b 影響結腸癌預后的機制。