基于網絡藥理學探討人參皂苷Rg1對慢性粒細胞白血病的作用機制

周雯，周玥，李淵，韓艷軍，劉小虎

（云南大理大學組織學與胚胎學教研室，云南大理 671000）

慢性髓系白血病（Chronic myeloid leukemia，CML）是一種多能造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的克隆性骨髓增生性疾病。CML的特征是存在BCR-ABL1融合基因，該基因編碼一個組成型活性酪氨酸激酶，能夠啟動和維持疾病的致病驅動因子。致使大量下游信號通路激活，從而促進了遺傳不穩定的髓樣細胞的不受控制地擴增[1]，最終危及生命。目前主要采用伊馬替尼等酪氨酸激酶活性抑制劑（TKIs）靶向治療，盡管效果顯著，但部分患者原發性或繼發性耐藥、長期器官毒性等不良反應的出現限制了TKIs的臨床應用[2]。

中藥在傳統醫學中由于安全、毒副作用小，對肝腎刺激性較弱占據了重要的地位，在多部位、多靶點疾病的總體調控方面具有突出的優勢。人參皂苷Rg1是三七和人參的主要活性成分，具有多種生物學效應[3]。人參皂苷Rg1可改善腸道炎癥、血管生成和放射誘導的腸損傷[4]。Rg1可通過激活SIRT1/TSC2信號通路抑制急性髓樣白血病的細胞增殖并誘導其衰老[5]。此外，還有抗肝纖維化、抗腫瘤、延緩衰老、改善心血管系統代謝等功能[6]。Rg1的抗腫瘤也多有報道，但涉及CML的較少，其作用機制并不清楚，本文通過網絡藥理學研究Rg1作用于K562的靶點，為臨床研究提供新的思路。

一、研究方法

（一）人參皂苷Rg1作用靶點的預測

使用PubChem數據庫檢索“ginsenoside Rg1”，并保存其sdf格式文件。將Rg1的sdf格式文件導入PharmMapper平臺[7]。設置最大生成構象為300，人類蛋白作為藥效基團，預測人參皂苷Rg1的潛在靶點，利 用Uniprot數 據 庫 (https：//www.uniprot.org/)的Retrieve/ID mapping 功能將靶點蛋白名稱轉換為標準基因名稱。刪除重復基因，最終得到人參皂苷Rg1活性成分的作用靶點。

（二）人參皂苷Rg1和CML的交集靶點及互相作用網絡構建

以“chronic myeloid leukemia”為關鍵 詞 在GeneCards疾病數據庫中檢索，檢索結果以“相關分數”進行取值，根據中位數篩選出合適的基因數量進行后續分析。與人參皂苷Rg1作用靶點通過Excel取交集，即為人參皂苷Rg1作用于CML的靶點。利用微生信網站繪制出化合物—疾病靶標的韋恩圖。

（三）構建化合物—疾病蛋白互相作用網絡

將共同靶點導入STRING11.0數據庫，選擇研究物種為“智人”，最低相互作用域值設為highest confidence≥0.4，隱藏游離靶點，獲得靶點聯系網絡圖，保存csv格式文件，將文件導入Cytoscape3.7.2軟件構建PPI網絡。

（四）化合物—疾病之間分子對接驗證

利用RCSB PDB數據庫查找MAPK1(ERK)蛋白的晶體結構，將Rg1的Mol2結構式與蛋白晶體結構導入AutoDock vina、Pymol軟件中，檢測疾病靶蛋白與小分子化合物之間結合能力。

（五）Western blotting檢測p-ERK蛋白的表達

取2×106個K562放 入 培 養瓶，加入500μL 20μmol/L的Rg1，總液體體積為5mL Rg1濃度、時間篩選參考本課題組以往研究結果[8]。提取各組細胞總蛋白，測定總蛋白濃度，電泳、轉膜、封閉后，加入p-ERK一抗4℃過夜，TBST緩沖液漂洗2次，加入二抗，室溫反應2h，ECL增強發光試劑顯色，凝膠成像系統曝光。

二、結果

（一）Rg1作用于CML的蛋白靶點

在PharmMapper數據庫得到299個人參皂苷Rg1的作用靶點，將靶點去重后，經Uniprot數據庫進行基因名稱轉換后、剔除重復基因、無效基因名得到290個有效靶點。

（二）CML相關靶點數據庫構建及交集靶點的篩選

在GeneCards數據庫中檢索得到4560個CML的疾病相關靶點，根據“相關性得分”的中位數進行篩選，經三次取中位數后，最終將1141個靶基因納入考慮范圍。取人參皂苷Rg1和CML的靶點交集共得到93個疾病靶點，制韋恩圖，見圖1。

圖1 人參皂苷Rg1于CML相關靶點韋恩圖

（三）人參皂苷Rg1作用于CML的PPI網絡構建

人參皂苷Rg1與CML的蛋白互做分析，見表1、圖2。該網絡共包含93個節點，333條邊，平均節點度值為7.16，平均局部聚類系數為0.476。節點面積越大，顏色越亮代表度值越大。度值表示該靶點與其他靶點的關聯個數，度值越大表明該靶點與其他作用靶點聯系越緊密，在網絡中的作用越重要。該93個共同靶點是Rg1作用于疾病的關鍵分子基礎。其中SRC（癌基因酪氨酸蛋白激酶），MAPK1（絲裂原激活的蛋白激酶1），PIK3R1（磷脂酰肌醇3-激酶調節亞基α），GRB2（生長因子受體結合蛋白2），HRAS（GTPase HRas），PTPN11（酪氨酸蛋白磷酸酶非受體11型），LCK（酪氨酸蛋白激酶），MAPK8（裂原激活的蛋白激酶8），IGF1（胰島素樣生長因子I）等度值排行前10的靶點均可與17個及以上靶點相互聯系，提示這些靶點在治療方面的重要性。

圖2 PPI蛋白互作網絡圖

表 1 人參皂苷Rg1對AD作用靶點的拓撲學分析（前20位）

（四）分子對接結果

人參皂苷Rg1與MAPK1（ERK）進行對接，結合能為-7KJ/mol，一般認為配體與受體的結合能越低，其結合構象越穩定，發生的作用可能性越大。結合能小于0KJ·mol-1說明受體和配體可自發結合。見圖3。

圖3 分子對接

（五）Rg1對562細胞p-ERK相對蛋白表達量的影響

與對照組相比，Rg1組p-ERK蛋白表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。見圖4。

圖4 Rg1對562細胞p-ERK蛋白表達量的影響與對照組相比（P＜0.01）

三、討論

本研究利用網絡藥理學和分子對接的方法，探討了人參皂苷Rg1對CML的潛在作用機制。推測可能通過SRC、MAPK1、PIK3R1、GRB2、HRAS、PTPN11等度值排名較高的靶蛋白發揮治療CML的作用。

SRC（原癌基因酪氨酸蛋白激酶）是非受體蛋白酪氨酸激酶，在腫瘤的遷移中起到重要重用[9]。粘著斑（FAs）的周期性形成和分解是腫瘤細胞遷移的基礎。SRC已被證實為CML中的治療靶點[10]。因此我們選擇MAPK1（ERK）進行研究，MAPK1（絲裂原激活的蛋白激酶1），屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，它是MAP激酶信號轉導途徑的重要組成部分。通過調節轉錄、翻譯、細胞骨架重排來介導多種生物學功能，例如細胞生長、粘附、轉移和分化。李剛等研究表明，TUG-1可通過miR-370-3p/MAPK1/ERK信號通路，促進AML（急性髓樣白血病）細胞的遷移和侵襲能力[11]。分子對接后證明Rg1能與此靶點蛋白自發結合。本課題組證明Rg1作用于K562細胞后能抑制其增殖，但具體機制尚不完全清楚，本文使用網絡藥理學后找出潛在靶點進行實驗，western blotting結果顯示，Rg1組p-ERK的表達明顯降低，提示Rg1可以通過抑制p-ERK起到抗腫瘤的作用。

本研究通過網絡藥理學探究人參皂苷Rg1通過多靶點和多通路作用于白血病的分子機制。除了已知的靶點和通路，還挖掘出潛在的作用靶點，為后續的實驗提供了理論依據。