左卡尼汀通過TGF-β1/Smad通路對尿毒癥腹膜透析大鼠鈣磷代謝的影響

程艷艷，周艷萍，曹仁智

（北大醫療魯中醫院重癥醫學科，山東臨淄 255499）

尿毒癥（Uremia）是慢性腎衰竭的終末階段，水電解質紊亂和代謝性酸中毒合為其主要特征，同時伴有鈣缺乏癥和磷過多等癥狀[1]。腹膜透析（peritoneal dialysis, PD）為治療終末期腎臟病的主要腎臟替代療法之一，具有持續清除廢物、對患者活動影響較小、治療成本較低等優點[2]。然而，持續暴露于機械應力、葡萄糖透析液及導管并發癥等可導致腹膜炎癥和損傷，從而導致進行性血管生成和腹膜纖維化，進而導致超濾衰竭。左旋肉毒堿，又稱左旋肉堿，主要分布在心臟和骨骼肌中，可用于促進體內脂質代謝，提高氧化分解能力，增強細胞活力，改善機體組織功能障礙。尿毒癥在腹膜透析過程中造成左旋肉堿損失，一定程度地促進了超濾失敗的發生。研究[3]顯示，通過外源性補充左卡尼汀和左旋肉堿，可以改善腹膜透析患者機體的炎癥和營養狀況，有助于改善腹膜透析的效果，然而其分子機制尚不清楚。轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）是慢性腎臟病的標志物。研究[4]發現，Sma 和Mad相關蛋白（Sma and Mad-related protein, Smad）是TGF-β1下游的信號轉導蛋白，下調Smad 可以預防腎病小鼠腎衰竭[5]。本研究通過復制大鼠尿毒癥腹膜透析模型，擬探討左卡尼汀對尿毒癥腹膜透析大鼠的腎臟損傷是否具有保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30 只SPF 級健康成年雄性SD 大鼠購自中國醫學科學院動物實驗中心[實驗動物生產許可證號：SCXK（遼）2018-0004]，體重（200±20）g。所有大鼠均在實驗動物中心自由飲用食水，研究經醫院動物實驗倫理委員會批準。

1.2 試劑及藥物

兔源一抗TGF-β1、二抗羊抗、Smad3、p-Smad3和GAPDH 均購自美國Abcam 公司，血肌酐和血尿素氮酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自上海明秀生物技術有限公司，DAB 顯色試劑盒、BCA 蛋白質濃度測量試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑盒、蛋白質提取試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司，大鼠甲狀旁腺激素ELISA 試劑盒購自上海濟寧酶有限公司。左卡尼汀口服液（規格：10 mL∶1 g）購自東北制藥集團公司沈陽第一制藥廠，低鈣腹膜透析液2 000 mL（含1.5%葡萄糖）購自廣州百特醫療用品有限公司。

1.3 模型復制方法

適應性喂養7 d 后，將大鼠麻醉，備皮并消毒左腎手術部位皮膚，切開1.5 cm 切口，剝離周圍的脂肪組織，結扎上1/3 腎臟，切除1/3 腎臟并止血。采用相同的方法切除下1/3 腎臟，直至無出血，復原剩余左腎，縫合肌層和皮膚，采用青霉素消毒。7 d 后，采用相同方法進行右腎全腎切除術。2 d 后，斷尾取血，檢測血肌酐，當血肌酐水平超過2 倍正常值，表明尿毒癥模型復制成功。尿毒癥大鼠模型復制成功后，將腹膜透析管插入腹腔并注入2 mL 1.5%低鈣腹膜透析液，1 次/d，直到尿毒癥腹膜透析管通暢，表明尿毒癥腹膜透析大鼠模型復制成功。將模型復制成功的大鼠隨機分為模型組和左卡尼汀組，另將切開并剝離脂肪組織但不結扎腎臟，行腹腔插腹膜透析管處理的大鼠作為假手術組（對照組），每組10 只。模型組和對照組腹腔注射生理鹽水1 mL/d；左卡尼汀組腹腔注射左卡尼汀40 mg/kg，1 次/d，持續6 周。然后切取實驗所需的組織。

1.4 取材

給藥前后稱重。給藥結束，各組大鼠均禁食但自由飲水1 d，麻醉下取尾靜脈血，常溫3 000 r/min離心，取血清，置于-20℃冰箱冷凍保存備用。實驗結束后切取剩余腎臟組織，分離腎皮質，置于-80℃液氮，備用。

1.5 血生化指標檢測

嚴格按照說明書進行操作，檢測血清中肌酐、尿素氮、甲狀旁腺激素、鈣、磷水平。

1.6 腎臟組織TGF-β1/Smad通路相關蛋白檢測

采用蛋白提取試劑盒提取儲藏于-80℃液氮的大鼠腎臟組織的總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒法測定總蛋白濃度，采用凝膠電泳分離蛋白質，將其轉移至PVDF 膜上，采用5%脫脂奶粉密封2 h，添加一抗TGF-β1、Smad3、p-Smad3，一抗的工作濃度均為1∶5 000，在4℃下孵育過夜，加入羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h，采用DAB 試劑顯色，并用蛋白凝膠成像儀進行拍照和定量分析。以GAPDH 為內參。

1.7 統計學方法

數據分析采用SPSS 25.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠模型復制前后體重的比較

模型復制前，3 組大鼠體重比較，經方差分析，差異無統計學意義（P>0.05）。給藥結束后，3 組大鼠體重比較，差異有統計學意義（P<0.05）；進一步兩兩比較，模型組和左卡尼汀組大鼠體重較對照組減輕（P<0.05），左卡尼汀組大鼠體重較模型組增加（P<0.05）。見表1。

表1 3組大鼠模型復制前后體重的比較（g，±s）

表1 3組大鼠模型復制前后體重的比較（g，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別對照組模型組左卡尼汀組F 值P 值給藥后384.24±15.83 287.13±13.67①321.83±12.73①②121.178 0.000模型復制前203.14±12.87 206.21±13.41 204.18±13.06 0.142 0.868

2.2 3組大鼠給藥后血肌酐、尿素氮水平的比較

給藥結束后，3 組大鼠的血肌酐、尿素氮比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）；進一步兩兩比較，模型組和左卡尼汀組大鼠血肌酐和尿素氮水平較對照組升高（P<0.05），左卡尼汀組大鼠血肌酐和尿素氮水平較模型組降低（P<0.05）。見表2。

表2 3組大鼠給藥后血肌酐、尿素氮水平的比較（μmol/L，±s）

表2 3組大鼠給藥后血肌酐、尿素氮水平的比較（μmol/L，±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別對照組模型組左卡尼汀組F 值P 值血尿素氮7.28±3.61 18.13±4.72①12.46±2.96①②20.047 0.000血肌酐27.14±5.83 68.31±9.72①43.27±5.86①②79.301 0.000

2.3 3 組大鼠給藥后血甲狀旁腺激素、鈣、磷水平的比較

給藥結束后，3 組大鼠的血甲狀旁腺激素、鈣、磷比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）；進一步兩兩比較，模型組和左卡尼汀組大鼠血甲狀旁腺激素、磷水平較對照組升高（P<0.05），血鈣水平降低（P<0.05），左卡尼汀組血甲狀旁腺激素、磷水平較模型組降低（P<0.05），血鈣水平較模型組升高（P<0.05）。見表3。

表3 3組大鼠給藥后血甲狀旁腺激素、鈣、磷水平的比較（±s）

表3 3組大鼠給藥后血甲狀旁腺激素、鈣、磷水平的比較（±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別鈣/（nmol/L）磷/（nmol/L）對照組模型組左卡尼汀組F 值P 值甲狀旁腺激素/（ng/L）324.16±66.82 483.17±72.09①403.11±70.82①②12.920 0.000 1.48±0.26 2.96±0.33①2.23±0.28①②64.453 0.000 2.73±0.37 1.72±0.24①2.16±0.31①②26.473 0.000

2.4 3組大鼠給藥后腎臟TGF-β1/Smad通路蛋白相對表達量的比較

給藥結束后，3 組大鼠TGF-β1和p-Smad3 蛋白相對表達量比較，經方差分析，差異有統計學意義（P<0.05）；進一步兩兩比較，模型組和左卡尼汀組TGF-β1和p-Smad3 蛋白相對表達量較對照組升高（P<0.05），左卡尼汀組TGF-β1和p-Smad3 蛋白相對表達量較模型組下降（P<0.05）。3 組大鼠Smad3 蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表4和圖1。

圖1 3組大鼠給藥后腎臟TGF-β1/Smad通路的蛋白表達

表4 3組大鼠給藥后腎臟TGF-β1/Smad通路蛋白相對表達量的比較 （±s）

表4 3組大鼠給藥后腎臟TGF-β1/Smad通路蛋白相對表達量的比較 （±s）

注：①與對照組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

組別對照組模型組左卡尼汀組F 值P 值p-Smad3 0.26±0.06 0.48±0.12①0.37±0.09①②13.908 0.000 TGF-β1 0.31±0.07 0.62±0.14①0.42±0.11①②20.246 0.000 Smad3 1.06±0.25 1.02±0.18 0.97±0.24①②0.400 0.674

3 討論

現有治療條件下，終末期腎臟疾病患者必須依靠腎臟替代療法才能生存[6]。在腹膜透析、血液透析及腎臟移植這3 種主要的替代療法中，腹膜透析具有價格低廉、操作簡便、對血流動力學的影響較小、對殘余腎功能的保護更好等優點，因而成為終末期腎臟病患者的首選腎臟替代療法[6]。然而，近期研究顯示，隨著腹膜透析時間的推移，腹膜纖維化引起的超濾衰竭發生率逐漸增加，找到減少尿毒癥患者腹膜透析并發癥并保護腎臟功能的治療藥物或干預手段尤為迫切且重要[7]。

左旋肉堿作為氧化脂肪酸的必需物質，分布于心臟和骨骼肌中，健康成人可以自身合成20 g 左右的左旋肉堿。左旋肉堿不僅能促進體內脂質代謝，還能在線粒體中產生短鏈酰基，促進線粒體基質同長鏈脂肪酸相結合，提高氧化分解的能力，增強細胞活力，改善機體組織功能障礙[8-9]。對慢性腎功能不全的患者，左旋肉堿的含量會明顯降低，并且還會在透析過程中造成一定程度的損失，透析患者補充左旋肉堿對改善透析效果具有積極意義[10]。左卡尼汀是從哺乳動物中提取的能量代謝產物，屬于維生素樣營養素，即商業化的左旋肉堿。本研究采用左卡尼汀連續給藥尿毒癥腹膜透析大鼠6 周，結果顯示，與對照組比較，模型組大鼠的體重降低，但與模型組比較，左卡尼汀組大鼠體重增加，提示左旋肉堿有助于改善尿毒癥腹膜透析大鼠的體質。

肌酐是人體肌酸代謝的產物，血肌酐幾乎全部經腎小球濾過進入原尿，不被腎小管重吸收，肌酐的每日生成量幾乎恒定，因此血肌酐水平為穩定值，測定血肌酐濃度可以反映腎小球的濾過功能，成為衡量腎功能的重要指標[11]。肌酐對機體的腎損傷高度敏感，因此可以在腎損傷的早期對其進行評估。本研究顯示，與對照組比較，模型組和左卡尼汀組大鼠血肌酐、尿素氮水平均升高，與模型組比較，左卡尼汀組大鼠血肌酐和尿素氮水平均降低，本研究結果與申屠偉豐[12]等的報道一致，提示左卡尼汀可改善腎小球濾過作用，降低腹膜透析大鼠血肌酐及尿素氮水平。

在慢性腎臟疾病患者中，隨著腎纖維化的進展，腎臟排磷能力的下降，血磷的增加，1，25-（OH）2D3的生成減少，腸道對鈣吸收下降，進而導致甲狀旁腺功能障礙，導致血鈣降低、血磷升高，血鈣、血磷水平異常可誘發甲狀旁腺功能亢進、腎骨病[13-15]。本研究顯示，與模型組比較，左卡尼汀組大鼠血鈣升高，血甲狀旁腺激素、磷水平降低，提示左卡尼汀可改善腎小管功能，促進鈣再吸收，強化腎功能促磷代謝，血鈣水平的升高可激活負反饋機制，降低甲狀旁腺激素水平。

研究表明，TGF-β1可增強膠原蛋白轉換來刺激單層細胞修復，進而影響組織修復過程[16]。Smad的磷酸化可通過TGF-β1與膜表面受體的結合而被激活，激活的Smad 可調節靶基因轉錄[17]。Smad3 是Smad 家族的成員，并且已證明Smad3 促進慢性腎病中的細胞纖維化[18]。本研究顯示，與對照組比較，模型組TGF-β1和p-Smad3 蛋白相對表達量升高，提示尿毒癥腹膜透析大鼠TGF-β1/Smad 被激活，腎細胞纖維化程度增強，腎功能顯著降低。給予左卡尼汀干預后，腎組織的TGF-β1和p-Smad3 蛋白相對表達量降低，可見左卡尼汀可通過抑制TGF-β1/Smad 信號通路活化而保護受損的腎臟。

綜上所述，左卡尼汀可通過抑制尿毒癥腹膜透析的TGF-β1/Smad 通路活化來改善腎臟功能，提高血甲狀旁腺激素、鈣、磷水平，改善鈣磷代謝平衡。