FaGST基因過量表達獲得擬南芥轉基因植株

陳 錫，陳 瑩，劉曉霞，劉重陽，吳 溪，姚文琴，王小利*

(1.貴州省草業研究所，貴州 貴陽550006； 2.貴州大學 生命科學學院/山地植物資源保護與種質創新教育部重點實驗室/喀斯特山區植物資源利用與育種國家地方聯合工程研究中心，貴州 貴陽550025)

0 引言

【研究意義】谷胱甘肽轉移酶(glutathione transferases，GSTs)普遍存在于動物、植物和微生物中，是一個龐大的超基因家族編碼的多功能性酶。GST在植物中最早被發現，是因為其對除草劑具有解毒作用，隨著GST被大量發現，GST的其他功能也逐漸被人們知悉。GST具有催化活性和非催化活性功能，催化活性是GST以某些物質或谷胱甘肽(GSH)為底物，以各種酶及脫谷胱甘肽等形式進行酶催化反應，形成復合物，將有害物質運輸至體外，從而起到解毒作用[1]；非催化活性是GST參與細胞內激素、次生代謝物等合成和運輸，在植物生長發育和次生代謝等過程中發揮重要作用[2]。研究GST對植物生長和抵御脅迫的分子機制，對改善或提高植物受脅迫能力具有重要的現實應用意義?！厩叭搜芯窟M展】JIA等[3-4]研究表明，GST在植物體中表達受鹽和重金屬的脅迫。當植物遭受逆境脅迫時，GSTs通過解毒和抗氧化作用避免植物細胞免受逆境傷害[1]。劉興鳳[5]研究發現，滸苔在溫度、鹽度、光照和紫外光等逆境脅迫下GST的表達量提高，推測這是導致滸苔爆發成為黃海綠潮的重要因素之一。楊舒涵等[6]研究表明，在鎘脅迫下能源甜菜BvGST基因發揮著重要的解毒作用，可能是因為GST通過氧化逆境進行活性解毒，從而影響其細胞對重金屬鎘離子的代謝調控。梁志樂等[7]研究發現，大蒜AsGST基因可能與耐鹽性有密切關系，在植物抵御鹽脅迫機制中發揮重要調控作用?！狙芯壳腥朦c】目前，鮮見關于FaGST基因抗鹽及解毒性功能的研究報道。利用前期成功構建的帶有潮霉素特異基因空載體和FaGST基因過量表達載體，通過花序浸染法，以獲得轉基因擬南芥植株，經PCR驗證，利用實時熒光定量PCR技術分析其表達量?！緮M解決的關鍵問題】探明FaGST基因的功能和分子調控機制，以期為其后期的抗性利用與研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種子 擬南芥品種為哥倫比亞(Col)，其種子由武漢轉導生物實驗室提供。

1.1.2 菌株、載體及引物 大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、根癌農桿菌GV3101(Agrobacteriumtumefaciens)和pCAMBIA1300-35S載體，均由武漢轉導生物實驗室提供；試驗采用引物序列見表1。

表1 試驗采用的引物序列

1.1.3 試劑、酶及儀器 植物DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；卡那霉素(Kan)、潮霉素(Hyp)、DNA Marker 2000、RNA反轉錄試劑盒和2X SYBR Green qPCR Master Mix，均購自安諾倫(北京)生物科技有限公司；TB1213核酸分析儀，購自廣州碩譜生物科技有限公司；A28132熒光定量PCR儀，Thermo Fisher Scientific。

1.2 方法

1.2.1 轉基因擬南芥植株的培養 采用花序侵染方法進行，將泥炭土∶蛭石=1∶1的基質混勻置于含有足夠營養液的托盤中，土壤吸水潮濕后，水盤中剩余少量水為宜，將擬南芥種子點播于營養土中，置于人工氣侯室培養。培養條件：溫度(22±2)℃，濕度65%，光照16 h，黑暗8 h，培養至開花期備用。利用實驗室前期成功構建的空載體pCAMBIA1300-35S和過表達載體pCAMBIA1300-35S-FaGST(均含植物體內沒有的特異基因潮霉素)(圖1)菌液，LB培養菌液，收集菌體重置于5%的蔗糖溶液(現配現用)，加入0.01%的表面活性劑silwet L-77，去除已結實的莢果，將花序浸入菌液中60 s，保濕過夜，7 d后再次轉化，待結莢成熟時收種。將種子用次氯酸鈉消毒2 min，用無菌牙簽接種于含50 mg/L卡那霉素(kan)和30 mg/L潮霉素(Hyp)的MS培養基中，4℃倒置2 d，光照培養箱里正置培養約7 d，挑選生長健壯的無菌苗移栽至營養土中，培養收取T1代種子，再經潮霉素篩選繼續種植收取T2代種子，最后收到T3代純合種子。

注：A為空載體pCAMBIA1300-35S，B為過表達載體pCAMBIA1300-35S-FaGST。

1.2.2 轉基因擬南芥植株的鑒定 以獲得的擬南芥轉基因植株嫩葉總DNA為模板，利用潮霉素hpt基因對獲得轉基因擬南芥植株進行PCR檢測。剪取T3代轉化植株葉片，稱取100 mg鮮重，利用CTAB法提取DNA，設計NPTII特異引物進行PCR檢測。PCR體系：DNA模板1 μL、10×PCRbuffer 2 μL、dNTP mixture (2 mmol/L each) 0.4 μL、NPTII-F Primer (10 μmol/L) 0.2 μL、NPTII-R Primer (10 μmol/L) 0.2 μL、rTaq DNA 聚合酶 (1 U/μL) 0.2 μL、ddH2O 16 μL。PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環；72℃延伸10 min，25℃ 1 min，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 轉基因擬南芥總RNA提取及 cDNA合成 根據RNA試劑盒操作說明提取擬南芥葉片總RNA，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸分析儀檢測；按照反轉錄試劑盒的操作說明合成cDNA第一鏈。

1.2.4 轉基因擬南芥熒光定量分析 根據FaGST基因序列設計熒光定量特異引物FaGST-F和FaGST-R。利用實時熒光定量PCR技術分析擬南芥轉基因植株中FaGST基因的表達量，以野生型擬南芥(WT)植株表達量(1.00)為對照。操作步驟參照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書進行。以擬南芥actin為內參基因，引物序列為actin-F和actin-R?？傮w系20 μL，其中SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL、FaGST-F(10 μmol/L)0.5 μL、FaGST-R (10 μmol/L)0.5 μL、cDNA模板 1 μL、ddH2O 8 μL。反應液全程冰上配制，置于實時熒光定量PCR儀Applied BiosystemsTMQuantStudioTM3 & 5上進行反應。反應程序為95℃ 2 min；95℃ 15 s，60℃ 15 s，40個循環。擬南芥FaGST基因的相對表達量利用2-ΔΔct計算。

1.3 數據處理

采用Excel 2007處理數據與制圖。

2 結果與分析

2.1 FaGST基因轉化擬南芥植株的鑒定

從圖2看出，經PCR檢測后有6株空載體轉基因陽性植株和8株轉FaGST基因擬南芥陽性植株出現明亮條帶，野生型擬南芥植株(WT)無條帶，表明已成功獲得擬南芥轉基因純合植株。野生型擬南芥植株形態和轉FaGST基因擬南芥植株形態見圖3。

注: B為空白對照，N為陰性對照，P為陽性對照。

圖3 野生型(WT)與轉FaGST基因(35S:FaGST)擬南芥植株

2.2 轉基因擬南芥的FaGST基因表達量

從圖4看出，6株(E1～E6)轉空載體基因擬南芥植株FaGST基因的相對表達量變化不明顯，為1.03～1.08，與野生型擬南芥植株基因表達量(1.00)相近，差異不顯著；8株轉基因擬南芥植株(T1～T8)FaGST基因的相對表達量均明顯提高，為1.31～2.06；T1、T2、T5和T6顯著高于WT，T3、T4、T7和T8極顯著高于WT，說明FaGST基因在擬南芥中已過量表達。

注： WT為野生型植株表達量，T1～T8為轉FaGST基因擬南芥植株表達量，E1～E6為轉空載體基因擬南芥植株表達量；*、**分別表示轉基因擬南芥植株的FaGST基因表達量較野生型植株差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

3 討論

逆境脅迫對植物生長發育具有一定的影響，谷胱甘肽作為二硫還原劑，調控由逆境所引起的逆境相關基因表達，其中GSTs具有重要作用[8]。LIU等[9-10]研究表明，GSTs對植物具有一定程度抵御脅迫的作用，如大豆GmGSTL1基因在煙草中過表達提高BY-2細胞數量，在鹽脅迫下轉大豆GmGSTL1基因提高擬南芥的存活率和增強了抗性。XU等[11]報道，番茄GST基因在擬南芥植物中過表達，其在鹽脅迫和干旱脅迫條件下的生長情況變好。梁志樂等[7]研究表明，GST參與植物抵御鹽脅迫的具體途徑可能是通過將鹽脅迫產生的有毒害作用的活性氧還原，從而減少對細胞結構和功能的損壞，保護細胞免受氧化損傷。陳錫等[12]研究發現，高羊茅FaGST1基因位于細胞核，在干旱、高溫、高鹽脅迫和低氮脅迫下均出現抑制表達。表明，GST促使植物抵御脅迫，具有響應生物和非生物脅迫的功能。因此，研究GST有助于闡明植物生長和抵御脅迫的分子機制，對脅迫植物生存能力的改善具有現實意義。

研究結果表明，經PCR檢測后有6株空載體轉基因植株和8株轉FaGST基因擬南芥植株出現明亮條帶，野生型擬南芥植株(WT)則無條帶，成功獲得擬南芥轉基因純合植株，6株轉空載體基因擬南芥植株FaGST基因表達量變化不大，與WT表達量相近；8株轉基因擬南芥植株的FaGST基因表達量明顯提高，且與WT差異顯著或差異極顯著。說明該基因在擬南芥中已過量表達，可為后期FaGST基因的抗性研究提供理論依據。

4 結論

利用空載體pCAMBIA1300-35S和已構建成功的過表達載體pCAMBIA1300-35S-FaGST導入農桿菌中，通過花序侵染法進行轉基因擬南芥植株的培養，得到6株轉空載體基因擬南芥植株FaGST基因表達量變化不大，且與野生型擬南芥植株(WT)表達量相近，8株轉基因擬南芥植株的FaGST基因表達量明顯提高；成功獲得擬南芥轉基因純合植株，FaGST基因在擬南芥植株中已過量表達。