腹部推拿對運動性疲勞大鼠外周血單個核細胞能量代謝及炎性反應相關因子的影響

鈕妍 王澤中 國生 沈潛 楊靖頤 宋紅志 付國兵 王康

在過量運動發生后，由于皮質醇和腎上腺素等應激激素的超量分泌，血流動力學發生顯著變化，加之氧化應激水平的急劇升高，導致外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMCs)功能與結構的異常，進而引發暫時性的運動性免疫抑制[1]。此時，機體的防御屏障上就像打開了許多小窗戶，學術界稱之為免疫系統的“開窗現象”[2]。在這一階段，不僅會出現疲勞、乏力、注意力下降等主觀癥狀，也會增加各種細菌、微生物、病毒入侵的幾率。

本團隊在前期研究中發現推拿可顯著改善運動性疲勞(exercise-induced fatigue，EF)引起的PBMCs凋亡及亞型分布失衡，從而減輕運動性氧化應激引起的免疫炎性損傷[3]。基于EF狀態下引起氧化應激介導的細胞凋亡主要通過線粒體的內源性凋亡途徑實現，課題組以調控線粒體能量代謝及細胞凋亡的關鍵蛋白腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activited protein kinase，AMPK)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α,PGC-1α)、半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)為切入點，通過分子生物學研究方法，初步探索了推拿改善EF模型大鼠PBMCs凋亡及免疫炎性抑制的調節機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性Wistar大鼠30只，體質量(150±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK(京)2019-0009。大鼠飼養于醫院實驗動物中心SPF級動物房，溫度18～22℃，相對濕度40%～60%，自由進食和飲水。預訓練及造模過程中先后剔除不會跑步大鼠2只及造模失敗大鼠4只，最終共有24只大鼠完成實驗。本次實驗通過北京中醫藥大學東方醫院實驗動物倫理委員會審核(編號：201940)。

1.2 實驗試劑

蛋白酶抑制劑(瑞士Roche，批號：4693116001)，蛋白染色劑(美國Bio-Rad，批號：5000006)，磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMP-activited protein kinase,pAMPK，1∶1 000，美國CST，批號：2535S)，AMPK(1∶1 000，美國CST，批號：5832S)，PGC-1α(1∶1 000，美國Affinty Biosciences，批號：AF5395)，caspase-3(1∶1 000，美國SANTA CRUZ，批號：sc-7272)，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)(1∶1 000，美國SANTA CRUZ，批號：sc-52012)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)(1∶1 000，美國SANTA CRUZ，批號：sc-52746)，GAPDH(1∶4 000，英國Abcam，批號：ab128915)，ECL顯影液(美國thermo fisher scientific，批號：NCI5079)，轉印膜(德國Merck Millipore，批號：IPVH00010)，HRP二抗(1∶4 000，上海Beyotime，批號：A0208)。

1.3 分組及模型制備

大鼠適應性喂養7天后，采用跑臺運動的方法建立運動性氧化應激模型。以坡度為0°，10 m/分鐘的速度跑20分鐘，每天1次，連續3天，作為大鼠適應性跑臺訓練。訓練后，剔除不會跑步以及體質量數據差異較大的大鼠2只，后隨機取出8只大鼠作為空白組。剩余20只大鼠運用改進的遞增跑臺有氧力竭運動法進行造模，為期7天[4]。采用精神不振、對疼痛刺激反應遲鈍、毛散且無光澤等行為學觀察指標，并滿足隨機外周血乳酸含量>10 mmol/L視為造模成功。將16只成模大鼠隨機分為模型組及推拿組，每組各8只。

1.4 干預方法

推拿組每日力竭運動后予推拿干預1次，連續21天。干預方案如下：實驗施術人員用不透光棉袋套住大鼠頭部及胸部，隨后將大鼠置于自然俯臥體位，一手輕按大鼠項背部安撫其情緒，另一手運用中指揉法先后作用于雙側天樞穴，作用力1.5 N，頻率60次/分鐘，雙側同時施術，干預5分鐘；隨后食、中、無名三指松振法作用于中脘穴至關元穴的任脈區域，作用力1 N，頻率200次/分鐘，各干預5分鐘。每次腹部推拿干預時間總計15分鐘。

空白組及模型組在推拿組手法干預時段，給予同樣時長及力度的抓取固定。

1.5 指標檢測

1.5.1 外周血Lac、BUN及CK含量 各組大鼠在末次干預結束后禁食不禁水12小時，以6 mL/kg的劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，腹主動脈取血，在EP管中室溫靜置1.5小時，以3 000 r/分鐘離心10分鐘，取上清液，以全自動生化分析儀對各組血清樣本進行相關指標檢測。

1.5.2 PBMCs中pAMPK、AMPK、PGC-1α、caspase-3、TNF-α及IL-1β蛋白表達水平 以蛋白免疫印跡法進行檢測。每組隨機取3只大鼠的外周血清樣本并分離PBMCs，對分離后的PBMCs用含有蛋白酶抑制劑的裂解液進行裂解(50 mmol/L Tris-Cl pH 7.4，1 mm EDTA pH 8.0，250 mm NaCl，1% Triton-X)。

蛋白裂解液濃度利用Bradford法進行測量。10 μg從PBMCs細胞中獲得的細胞裂解液與5×樣品緩沖液(15 g SDS，15.6 mL 2M Tris pH 6.8，57.5 g glycerol，16.6 mL β-mercaptoethanol)混合后，將樣品上樣至10%聚丙烯酰胺凝膠中，SDS-PAGE分離并轉移至PVDF膜上。用含0.1%吐溫的4%牛奶進行封閉后，加入以下抗體，4℃孵育過夜。用含0.1%吐溫的PBS溶液將膜洗3遍后，加入含0.1%吐溫的4%牛奶以及HRP二抗在室溫條件下孵育1小時。取出膜，在膜上滴加ECL顯影液并放入MiniChemi成像系統進行拍照。Image J軟件進行光密度分析。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 推拿對EF大鼠外周血疲勞相關代謝產物的影響

與空白組比較，模型組外周血中Lac、BUN、CK水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，推拿組外周血中的Lac、BUN及CK水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。見表1。

表1 各組EF大鼠外周血Lac、BUN、CK水平比較

2.2 推拿對EF大鼠PBMCs線粒體能量代謝及凋亡關鍵因子的影響

與空白組比較，模型組PBMCs中的pAMPK/AMPK及PGC-1α蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，caspase-3蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，推拿組PBMCs中的pAMPK/AMPK及PGC-1α蛋白表達水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，caspase-3蛋白表達水平出現下降趨勢。見表2、圖1。

表2 各組EF大鼠PBMCs中pAMPK/AMPK比值、 PGC-1α、caspase-3表達水平比較

圖1 各組EF大鼠PBMCs中AMPK、pAMPK、PGC-1α、

2.3 推拿對EF大鼠PBMCs中炎性因子水平的影響

與空白組比較，模型組PBMCs中的TNF-α及IL-1β水平顯著上調(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，推拿組PBMCs中的TNF-α及IL-1β水平顯著下調(P<0.05，P<0.01)。見表3、圖1。

表3 各組EF大鼠PBMCs中TNF-α、IL-1β水平比較

dP<0.01。

3 討論

EF歸屬于中醫學“虛勞”范疇，病機為氣血不足，痰濁內生。本團隊在長期臨床實踐中發現此病的治療應予以攻補兼施之法，由于脾主肌肉，為后天之本、氣血生化之源，在治療過程中既要通過手法加速“瘀濁”代謝，同時更要重視補益脾胃之氣。因此，臨床治療不僅是在疲勞的肌肉局部施術，更應注重腹部手法施術。腹部推拿不僅具有健脾化濁的功效，同時兼顧培補元氣，在臨床上亦取得了顯著的療效[5-6]。

本次研究精簡了臨床處方，選取“天樞、中脘、關元”三個具備臨床核心治療思路的代表性腧穴，在控制變量的基礎上，最大程度還原了腹部推拿的治療思路。結果顯示，腹部推拿后EF模型大鼠外周血中Lac、BUN及CK等疲勞代謝產物的水平顯著下降，說明單純腹部推拿干預同樣具有較好的抗疲勞效果。天樞、關元、中脘三穴分別為大腸、小腸、胃之腹募穴，合而用之具有傳導糟粕、泌別清濁及化生氣血的功能，配合松振法及揉法寓通于補的手法特性，能夠更好地將腧穴的功效發揮出來[7]。從解剖角度來看，天樞穴毗鄰腎臟于腹部的體表投影，中脘、關元下方為腹主動脈，通過手法干預可加速血液循環與水液代謝，在保證能量供給的同時促使代謝廢物清除，從而保護心、肝、腎等臟器功能。

研究表明，中等強度運動可以增強免疫系統功能，而超量運動則會引起分泌型免疫球蛋白A、干擾素等免疫分子的水平下降，從而促進運動性免疫抑制的出現[8]。EF可伴有單核巨噬細胞和自然殺傷細胞數量減少，中性淋巴細胞功能減退，引起機體炎癥水平升高，進而導致糖皮質激素、血管緊張素、促腎上腺皮質激素、白細胞介素和腫瘤壞死因子數量降低，淋巴細胞數量減少，最后發生脾和胸腺免疫器官的萎縮與結構異常[9-10]。長期的EF狀態可使一過性的免疫抑制發展為慢性免疫力低下，最終使機體整體患病率上升，違背了“強身健體”的初衷。根據團隊前期的研究發現，推拿可改善EF導致的PBMCs凋亡比率升高及細胞功能障礙，可能是其減輕運動性免疫抑制，增強免疫系統功能的部分生物學機制[11]。因此，本次研究旨在明確推拿是否通過AMPK/PGC-1α/caspase-3信號途徑實現了對EF大鼠PBMCs的凋亡抑制作用，并改善了PBMCs的炎癥狀態。

結果顯示，腹部推拿干預后大鼠PBMCs的pAMPK/AMPK和PGC-1α蛋白表達水平顯著下降。AMPK既是細胞能量代謝的“開關”，又是維持線粒體穩態的關鍵因子[12]，PGC-1α是線粒體生物合成的直接調控因子[13]。實驗結果說明腹部推拿或可改善PBMCs的整體能量代謝水平，促進線粒體的生物合成。caspase-3表達水平在推拿后雖沒有顯著差異，但呈現出了一定下降趨勢，提示caspase-3的mRNA轉錄速率或蛋白降解速率發生了一定程度的衰減，但也不排除推拿不依賴caspase-3途徑抑制凋亡的可能，具體原因可通過延長干預時間及添加對基因轉錄情況的檢測進行完善。炎性因子IL-1β及TNF-α表達水平的顯著下調說明腹部推拿可以減輕EF狀態下機體廣泛氧化應激反應引起的PBMCs內免疫炎性反應，從而間接緩解PBMCs凋亡。已有研究發現線粒體功能障礙后釋放的活性氧可激活NLRP3炎性體，表明線粒體不僅調控著細胞凋亡，同時也在細胞炎癥反應中發揮著重要作用[14]。因此，腹部推拿可通過恢復PBMCs線粒體功能及生物合成，改善了PBMCs炎癥水平。

本次研究雖然初步明確了AMPK/PGC-1α信號鏈參與了推拿抗凋亡及炎癥效應的形成，但由于缺少抑制劑組，并未闡明該通路是否為實現手法效應關鍵環節。其次，本次研究中推拿調控casapase-3等凋亡關鍵信號分子的影響尚未明確，對推拿手法抗凋亡的作用途徑有待進一步研究。最后，由于本次研究的結果提示線粒體或是推拿手法作用的關鍵靶細胞器，日后圍繞線粒體生物合成及能量代謝關鍵信號通路開展研究也將有助于進一步揭示推拿改善運動性氧化應激及免疫抑制的生物學機制。