延胡索總堿理化性質及體外經皮滲透性的研究

姜明瑞 王志成 岳珠珠 張婧秋 魏曉彤 石雙慧 王夢琳 王慧楠 陳夢雨 王英姿

延胡索是中醫臨床理氣止痛之要藥，延胡索總堿是其主要藥效物質基礎，其中延胡索甲素、延胡索乙素及延胡索丑素是延胡索發揮鎮痛作用的主要活性成分[1-2]。目前與延胡索總堿體內吸收、分布、代謝密切相關的溶解度、油水分配系數等重要理化參數研究報道較少，尚未見關于延胡索總堿體外經皮滲透性能的研究。穴位貼敷療法是中醫內病外治的一種特色療法，藥物貼敷神闕穴，預期能夠發揮穴位刺激和藥物療效的雙重作用[3-6]，因此，探究延胡索總堿穴位及非穴位給藥的體外經皮滲透性能具有一定意義。本實驗建立酸性染料比色法測定延胡索總生物堿含量，同時采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定延胡索總堿中延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的含量，考察延胡索總堿包括延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的溶解度、油水分配系數等理化常數，并研究延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素神闕穴與非穴位體外經皮滲透性能，以期為延胡索總堿經皮給藥制劑研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康SD大鼠，雄性，體質量180～200 g，由斯貝福提供，許可證號：SCXK(京)2019-0010，適應性喂養3天。

1.2 實驗藥物

延胡索飲片(山東百味堂炮制，批號：180406)，經鑒定為罌粟科植物延胡索(CorydalisRhizoma)的干燥塊莖；延胡索總堿自制(批號：20200106、20200120、20200212)；延胡索甲素對照品(含量：98.0%，上海源葉生物科技有限公司，批號：Z25N8B49010)；延胡索乙素對照品(含量：99.8%，中國食品藥品檢定研究院，批號：110726-201819)；延胡索丑素對照品(含量：98.%，成都德思特生物技術有限公司，批號：DST200321-157)。

1.3 主要試劑與儀器

95%乙醇(北京虹湖聯合化工產品有限公司)；醋酸—醋酸鈉緩沖液、溴甲酚綠、三氯甲烷、三乙胺、磷酸、冰醋酸、乙酸乙酯(北京化工廠)；正辛醇(阿拉丁生化科技股份有限公司)；氮酮、薄荷油(麥克林生化科技有限公司)；甲醇(色譜純，美國Fisher Scientific公司)；其余試劑為分析純、水為去離子水以及純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

UltiMate 3000型HPLC，Chromeleon工作站；KH7200DB型超聲清洗機(昆山禾創超聲儀器有限公司)；756PC型UV(舜宇恒平科學儀器有限公司)；TGL-16M型高速離心機(湘儀實驗室儀器有限公司)；ZD-88型恒溫振蕩器(天竟實驗儀器廠)；TK-12D型透皮吸收擴散儀(上海鍇凱科技有限公司)；T10 basic高速電動組織勻漿機(德國IKA公司)等。

1.4 酸性染料比色法測定延胡索總堿的含量

1.4.1 測定條件 精密量取待測溶液1 mL置于分液漏斗中，加pH 4.5醋酸—醋酸鈉緩沖液12 mL，溴甲酚綠3 mL，三氯甲烷9 mL，振搖2分鐘，室溫靜置1小時后取下層三氯甲烷液，用無水硫酸鈉0.4 g除去殘留水分，避免干擾測定。取pH 4.5醋酸—醋酸鈉緩沖液1 mL按相同操作得空白對照溶液，測定吸光度[1,7]。

1.4.2 對照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品8 mg至50 mL容量瓶中，加醋酸—醋酸鈉緩沖液溶解定容，得0.160 mg/mL的對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取延胡索總堿2 mg，加醋酸—醋酸鈉緩沖液溶解定容，即得。

1.4.4 方法學考察 (1)測定波長的確定：精密量取醋酸—醋酸鈉緩沖液、對照品溶液和供試品溶液各1 mL分別置于分液漏斗中，按照“1.4.1”項下方法進行顯色，于紫外—可見分光光度計上掃描(200～800 nm)，以確定最大吸收波長。結果顯示，延胡索總堿溶液與延胡索乙素溶液的最大吸收均在411 nm處，且空白對照溶液在該處無此吸收，因此以411 nm作為檢測波長，結果見圖1。(2)線性關系考察：精密量取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別加醋酸—醋酸鈉緩沖液溶解定容至5 mL，按“1.4.1”項下方法測定吸光度，延胡索乙素的線性回歸方程為Y=5.2887X-0.0474，R2=0.9994，在0.01612～0.1612 mg/mL范圍內線性關系良好。(3)精密度考察：取對照品溶液，按照“1.4.1”項下方法連續進樣測定6次，結果RSD為0.11%，精密度良好。(4)重復性考察：精密稱取同一批延胡索總堿6份，按“1.4.3”項下方法制備延胡索總堿溶液，按照“1.4.1”項下方法進行測定，結果RSD為0.88%，重復性滿足樣品測定要求。(5)穩定性考察：取延胡索總堿溶液，按照“1.4.1”項下方法操作，于顯色后0、10、20、40、60、120分鐘進行測定，結果RSD為1.59%，表明樣品在120分鐘內穩定性良好。(6)加樣回收試驗：取已知延胡索總堿含量的延胡索總堿溶液6份，每份1 mL，分別加入等量含量相當的延胡索乙素對照品溶液，按照“1.4.3”的方法制備，按照“1.4.1”項下方法測定，平均加樣回收率為100.56%，RSD為1.63%，說明該方法回收率良好。

1.4.5 延胡索總堿樣品的測定 精密稱取3批不同批次的延胡索總堿，按照“1.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“1.4.1”項下方法進行測定，計算延胡索總堿的含量，每個供試樣品平行測定3次。

1.5 HPLC法測定延胡索總堿中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的含量

1.5.1 色譜條件[8]Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱；流動相甲醇-0.04 mol/L磷酸水溶液(70:30，用三乙胺調pH為6.0)；檢測波長281 nm；柱溫30℃；流速1 mL/分鐘；進樣量10 μL。

注：A 空白溶液；B 延胡索乙素對照品；C 延胡索總堿供試品。

1.5.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素對照品，加甲醇超聲定容至5 mL，制得濃度分別為1.8522、0.7804、0.6233 mg/mL的母液。

1.5.3 供試品溶液的制備 精密稱取延胡索總堿3 mg，加甲醇超聲定容至10 mL，過0.22 μm濾膜，即得。

1.5.4 延胡索總堿樣品測定 取3批延胡索總堿樣品，按照“1.4.3”項下制備延胡索總堿溶液，按照“1.4.1”項下方法測定峰面積并計算延胡索總堿樣品中延胡索甲素、延胡索乙素以及延胡索丑素3種單體成分的含量。

1.6 延胡索總堿溶解性的測定

精密稱取過量的延胡索總堿，分別加入到2 mL以下10種溶媒中：PBS緩沖液(pH 5.5)、PBS緩沖液(pH 6.86)、PBS緩沖液(pH 7.2)、生理鹽水、去離子水、5%乙醇的生理鹽水、10%乙醇的生理鹽水、20%乙醇的生理鹽水、甲醇、乙酸乙酯，37℃超聲溶解，得到延胡索總堿過飽和溶液，密封。于37℃的水浴中振搖48小時后，8000 r/分鐘，離心20分鐘，上清液稀釋適當倍數，采用酸性染料比色法和HPLC法分別測定，計算延胡索總堿在各個溶媒中的飽和溶解度以及延胡索總堿飽和狀態下各個溶媒中延胡索甲素、延胡索乙素以及延胡索丑素的溶解度，各組均平行測定3次。

1.7 延胡索總堿油水分配系數的測定

采用經典搖瓶法測定延胡索總堿油水分配系數，以正辛醇為油相，純水以及pH分別為5.5、6.86和7.2的磷酸鹽緩沖液為水相，等體積混合，常溫磁力攪拌飽和24小時后，靜置2小時，將上下兩層溶液分開，得到互相飽和的油相和水相。

取適量延胡索總堿分別加入用正辛醇飽和過的純水以及pH分別為5.5、6.86和7.2的磷酸鹽緩沖液5 mL，超聲溶解，振搖平衡4小時后于10000 r/分鐘，離心20分鐘，取上清液稀釋后，分別采用酸性染料比色法和HPLC法，測定初始濃度C。然后精密量取上述水相延胡索總堿溶液3 mL，分別加入預飽和的正辛醇3 mL，密封，37℃振搖48小時，靜置后于10000 r/分鐘，離心20分鐘，取下層水溶液，用0.22 μm的微孔濾膜濾過，采用酸性染料比色法及HPLC法測定濃度CW，按照公式(1)計算延胡索總堿、延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的油水分配系數，各組均平行測定3次。

1.8 延胡索總堿體外經皮滲透性能研究

1.8.1 供給液的配制 為測定延胡索總堿的穩態經皮滲透速率，所用的供給液為延胡索總堿的飽和溶液。取過量的延胡索總堿加入到pH 5.5的PBS緩沖液中，超聲溶解后，加塞密閉后將此混懸液磁力攪拌10小時，試驗時取出制成3組供給液：不含促透劑的飽和藥物溶液；飽和藥物溶液加入3%氮酮；飽和藥物溶液加入3%薄荷油，各組均平行測定3次。

1.8.2 神闕穴與非穴位的定位與離體皮膚的制備 神闕穴與非穴位定位時，在大鼠腹白線上，劍突與恥骨聯合上緣連線間的上2/3與下1/3的交點處為神闕穴，距離神闕穴區域約1 cm處的腹部皮膚為非穴位，盡量避開其他穴位[9]。離體皮膚的制備時，將大鼠處死，剃毛，迅速剝取神闕穴和非穴位皮膚，剔除皮下筋膜、脂肪等組織，生理鹽水洗凈，濾紙吸干，置于-20℃冰箱備用。試驗前將鼠皮自然解凍，并確保皮膚的完整性和均勻性。

1.8.3 體外經皮滲透實驗 擴散池為體積約8 mL的垂直式擴散池，接收池有效接觸面積為3.14 cm2。取神闕穴和腹部非穴位鼠皮，置于供給池與接收池之間，真皮層朝向接收池，在接收池中放入磁力攪拌子并注入預熱至37℃的接收液，至液面恰與真皮接觸，排凈氣泡。將擴散池置于(37±0.2)℃的恒溫水浴中，以300 r/分鐘開啟磁力攪拌。平衡30分鐘后，取供給液2 mL加至供給池中，分別于1、2、4、6、8、12、24小時取接收液0.2 mL，并立即補充等量37℃預熱的空白接收液。體外透皮結束后，用接收液洗凈大鼠皮膚，濾紙吸干，剪碎，加甲醇2 mL，高速勻漿2分鐘，10000 r/分鐘離心10分鐘，上清液以0.22 μm濾膜過濾，采用HPLC法法測定，按公式(2)計算延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素的單位面積累積滲透量(Qn)、滯留量(Qm)，以Qn對時間t作圖得體外經皮滲透曲線，直線部分的斜率為穩態滲透速率(JS)，增滲倍數(enhancement ratio，ER)為24小時的累積透過量(Q24)之比，樣品可儲存于4℃。

其中Cn和Ci分別是第n個和第i個取樣點的藥物濃度，V0為接收液體積(8 mL)，V為取樣體積(0.2 mL)，A為有效擴散面積(3.14 cm2)。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 酸性染料比色法測定延胡索總堿的含量

采用酸性染料比色法測定自制延胡索總堿樣品的質量分數，結果表明酸性染料比色法靈敏度較高，操作較簡單，重現性好，適用于延胡索總生物堿的含量測定。三批延胡索總堿質量分數分別為(59.54±0.64)%、(72.57±0.73)%、(67.37±1.63)%，均大于50%，自制所得的延胡索總堿純度較高，批間穩定性較好。

2.2 延胡索總堿中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的含量測定

3批延胡索總堿樣品中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的HPLC含量測定結果為延胡索甲素(80.04±3.32)mg/g、延胡索乙素(65.46±4.52)mg/g、延胡索丑素(37.00±2.61) mg/g。結果顯示延胡索總堿樣品中延胡索甲素的含量最高，約為延胡索乙素含量的1.2倍，延胡索丑素含量的2.2倍。

2.3 延胡索總堿溶解性的測定

延胡索總堿在10種不同溶劑中的溶解性結果見表1，隨著pH的增大，延胡索總堿在PBS緩沖液中的溶解度依次減小。延胡索總堿在生理鹽水和去離子水中的溶解度相近，但不同濃度乙醇的加入能夠增大其溶解度，其中延胡索總堿在含10%乙醇的生理鹽水的溶解性相對更好。甲醇和乙酸乙酯對延胡索總堿的溶解度相對較低，但是對延胡索甲素、延胡索乙素和延胡索丑素3種單體成分的溶解度較高，而且兩種溶劑中均為延胡索甲素>延胡索乙素>延胡索丑素，可能因為乙酸乙酯作為有機溶劑更易溶解延胡索總堿中的脂溶性生物堿，而對其它季銨類水溶性生物堿溶解性較差，從而導致對延胡索總堿整體的溶解度較小。10種溶劑除乙酸乙酯外，其余均為略溶，均滿足試驗所需漏槽條件，最終根據延胡索總堿溶解度選擇含10%乙醇的生理鹽水作為后續體外經皮滲透試驗的接收介質。

2.4 延胡索總堿油水分配系數的測定

正常皮膚表面偏酸性，pH約為5.5～7.0[10]，因此以經典搖瓶法測定延胡索總堿在純水和pH分別為5.5、6.86和7.2的磷酸鹽緩沖液中的油水分配系數，實驗結果見表2。延胡索總堿在純水以及pH為5.5～7.2 PBS緩沖液中的油水分配系數值為-1

2.5 延胡索總堿體外經皮滲透性能研究

大鼠神闕穴與非穴位體外經皮滲透試驗結果如圖2，神闕穴給藥的24小時累積滲透量高于非穴位，且3%氮酮和3%薄荷油能夠明顯促進延胡索總堿中延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的透皮吸收，且3%薄荷油的促透效果最佳。

對經皮滲透曲線的直線部分進行回歸，計算各試驗組的穩態透過速率(JS)、增滲倍數(ER)，其中，試驗組1至6分別為，結果見表3至表5，3種藥效成分的穩態透過速率與增滲倍數的大小順序均為神闕穴+3%薄荷油>非穴位+3%薄荷油>神闕穴+3%氮酮>非穴位+3%氮酮>神闕穴>非穴位，與非穴位組相比，神闕穴組的24小時累積透過量和穩態透過速率均增大，但差異無統計學意義(P>0.05)，而其他各組的24小時累積透過量和穩態透過速率均顯著增大，差異有統計學意義(P<0.05)，神闕穴的增滲倍數為對應非穴位組增滲倍數的1～1.5倍，且神闕穴+3%薄荷油的增滲倍數最大，對延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素的增滲倍數分別為9.757、 9.821、 4.126， 能夠明顯促進其經皮吸收，表明藥物經神闕穴給藥更有助于其滲透吸收。此外神闕穴的皮膚滯留量顯著高于非穴位(P<0.05)，與穴位經皮給藥的皮膚貯庫效應相吻合，且延胡索甲素的皮膚滯留量高于乙素和丑素，推測可能與其脂溶性較高有關。綜上，延胡索甲素、延胡索乙素以及延胡索丑素的體外經皮滲透性能良好，3%氮酮和3%薄荷油能夠促進3種藥效成分的透皮吸收，且3%薄荷油促透效果更佳；神闕穴用藥的累積透過量與滯留量高于非穴位皮膚，能夠初步證實延胡索總堿神闕穴用藥的可行性。

表1 延胡索總堿及3種單體成分在10種溶劑中的溶解性

表2 延胡索總堿及3種單體成分在不同溶劑中的油水分配系數

圖2 延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素經神闕穴和非穴位皮膚的經皮滲透曲線(n=3)

表3 延胡索甲素的體外經皮滲透相關滲透參數

表4 延胡索乙素的體外經皮滲透相關滲透參數

表5 延胡索丑素的體外經皮滲透相關滲透參數

3 討論

適宜的溶解性、油水分配性能等理化性質是藥物制劑研發所需的基礎信息，直接影響其劑型設計[11-13]。實驗研究結果表明，延胡索總堿以及延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索丑素在不同溶媒中的溶解性能不同，除乙酸乙酯外，延胡索總堿在其余9種溶媒中均為略溶，最終以10%乙醇生理鹽水作為后續體外經皮滲透試驗的接收介質。延胡索總堿在純水以及pH為5.5～7.2 的PBS緩沖液中的油水分配系數值-1

藥物的溶解性能、油水分配系數以及體外透皮吸收性能是新劑型研發中的重要理化性質參數，有助于預測藥物在體內的溶解、吸收、分布與轉運特點[14]。本研究建立了酸性染料比色法測定延胡索總堿樣品，并將HPLC法用于延胡索甲素、延胡索乙素及延胡索丑素的含量測定，考察延胡索總堿的溶解性、油水分配系數，對延胡索總堿的成藥性進行了評價，同時采用離體透皮試驗，研究了延胡索總堿在神闕穴與非穴位的體外透皮與滯留差異，初步確定神闕穴用藥的優勢，為后續延胡索總堿作為外用經皮給藥制劑的發展及其機制研究提供了實驗依據和理論基礎。