基于模糊層次分析法優選復方土茯苓止癢噴霧最佳提取工藝路線

梅凱 李鑫 李婷婷 郝逗逗 王靈敏 王昕怡 陳佳佳 劉葭 吳清

提取工藝作為制備中藥復方制劑的關鍵環節，直接影響制劑質量及臨床療效，優選提取工藝路線需要參考各藥味所含成分的理化性質和藥理作用，并結合制劑工藝和大生產實際情況[1-2]。由于中藥具有多成分、多靶點的特點，設置多指標及其評價成為了優化中藥復方制劑的關鍵。模糊層次分析法(fuzzy analytic hierarchy process, FAHP)是將模糊層次法和層次分析法結合，將評價指標和對象劃分為不同層次，同一層次的指標通過兩兩比較重要程度，組成模糊矩陣，通過計算得到各評價指標的權重系數[3-4]。本實驗以冰苓止癢噴霧為模型藥，研究模糊層次分析法在中藥提取工藝路線優選中的應用。

瘙癢是一種可以被機械、化學刺激所誘導的強烈搔抓欲望的感覺，也是糖尿病、膽汁淤積癥和艾滋病等系統性疾病的臨床表現[5-6]，調查發現，13.5%的成人患有瘙癢癥，嚴重影響患者的生活質量，需要及時治療[7]。目前對瘙癢癥的治療還僅限于抗組胺藥，局部和全身糖皮質激素或某些抗過敏藥、抗抑郁藥、抗癲癇藥的應用，但有一定的副作用[8-10]。

復方土茯苓方是臨床上治療瘙癢的有效中藥復方，由土茯苓、徐長卿和防風等藥味組成，共奏祛風止癢，清熱利濕的功效。臨床應用時為全方水提后外用，制備工藝簡單，但是有效成分利用率低，使用不方便。因此本論文對冰苓止癢方提取工藝進行考察，以優化制劑前處理方法。通過查閱方中各藥味的理化性質和抗瘙癢作用的強弱，參考原制劑工藝的臨床應用方式，設計兩條提取工藝路線，選擇化學指標結合藥效學指標作為評價指標，通過模糊層次分析法賦權、確定各因素指標合成權重，得到各工藝路線加權綜合得分，根據背部皮膚病理切片結果進行驗證，優選出最佳提取工藝路線。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器

CP-7800C型剃毛器(科德士電子廠)；低速離心機[艾卡儀器設備(廣州)有限公司]; BH-2型光學顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)；Ultimate 3000高效液相色譜儀(日本島津公司)；可變波長檢測器(日本島津公司)；INERTSIL ODS-3色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；RE-501型旋轉蒸發儀(北京神泰偉業儀器設備有限公司)；BZF50型真空干燥箱(上海BOXUN公司)；BT 125D電子分析天平(北京賽多利斯公司)；電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)；JY20002電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環水式真空泵(北京神泰偉業儀器設備有限公司)；SB-5200 DTD超聲波清洗機(寧波新芝生物科技有限公司)。

1.2 實驗藥物與試劑

土茯苓(北京三和藥業有限公司，批號：11050301)；苦參(北京三和藥業有限公司，批號：10620301)；防風(北京三和藥業有限公司，批號：103503101)；蒼耳子(北京仟草中藥飲片有限公司，批號：200915009)；艾葉(北京仟草中藥飲片有限公司，批號：210626006)；徐長卿(北京仟草中藥飲片有限公司，批號：20190541)；落新婦苷(批號：J29GB153016)、丹皮酚(批號：L15D9D77791)、升麻素苷(批號：S25GB162330)，以上標準品含量≥98%，均購于上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈(色譜級，美國Sigma)；冰醋酸(天津市致遠化學試劑有限公司，批號：2021032040)；娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)；4-氨基吡啶(Adamas-beta，批號：P1780631，用生理鹽水配成0.01%溶液)；生理鹽水(山東華魯制藥有限公司，批號：SD21010212)；復方醋酸地塞米松乳膏(華潤三九醫藥股份有限公司，批號：2107016S)；脫毛膏[利潔時家化(中國)有限公司]；小鼠組胺定量檢測試劑盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)購于泉州市睿信生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級ICR小鼠(23±2) g，雌雄各半, 斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2019-0010。

1.4 提取工藝路線設計

復方土茯苓方中君土茯苓臨床上用于多種皮膚病，包括足癬、濕疹和銀屑病等[11]。土茯苓中含有糖類、有機酸類、苯丙素類、黃酮和黃酮苷類、甾醇類、皂苷類及揮發油等多種化學成分，其中黃酮及黃酮苷類包括黃杞苷、異黃杞苷、落新婦苷、新落新婦苷、異落新婦苷、新異落新婦苷等，而落新婦苷是土茯苓中關鍵的活性成分和質量控制指標成分，為二氫黃酮醇苷類化合物，《中華人民共和國藥典》中規定土茯苓按干燥品計算，落新婦苷含量不得少于0.45%，具有抗炎、鎮痛、抗菌等多種生物活性[12-15]，文獻報道落新婦苷能夠抑制白介素-6(interleukin- 6，IL- 6)、白介素-1β(interleukin- 1β，IL- 1β)的表達、乙酸引起的小鼠扭體反應，對代表性的腋窩皮膚菌群有抑制作用[16-17]。

臣藥徐長卿目前較多地應用于皮膚類疾病，具有抗炎、鎮痛等作用。羅懷宇[18]發現含徐長卿提取液的牙膏樣品對急性炎癥具有明顯作用；徐長卿水煎劑可使小鼠扭體反應潛伏期明顯延長，扭體次數明顯減少[19]。文獻報道和《中華人民共和國藥典》已明確徐長卿的主要有效成分為丹皮酚[13,20]，丹皮酚可緩解二硝基氯苯誘導的小鼠特應性皮炎樣皮損的癥狀[21]。臣藥防風中的色原酮類成分，是其發揮藥效的主要物質基礎，防風提取物及色原酮類單體成分均有解熱、鎮痛、抗菌作用[22]，《中華人民共和國藥典》也明確了升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷兩種色原酮成分為防風的質量控制指標成分[13]。靜脈給藥防風色原酮單體，發現對致熱大鼠和熱板致痛小鼠有較好的解熱鎮痛作用[23]，趙娟等[24]發現防風色原酮提取物對大鼠關節炎發病率起到明顯的抑制作用。

君藥土茯苓主要活性成分落新婦苷、臣藥徐長卿主要活性成分丹皮酚和臣藥防風主要活性成分升麻素和5-O-甲基維斯阿米醇苷都具有水溶性差的特點，而其余三味中藥在方中占比小，能夠溶于乙醇，考慮到成本、時間等因素，故提取工藝路線一采用全方醇提，提取工藝路線二參考臨床用法，全方水提。

工藝路線一：(醇提組)稱取處方量的冰苓止癢方飲片，以8倍量70%乙醇為提取溶媒，回流提取2次，每次1小時，濾過，合并濾液，回收乙醇，濾液減壓濃縮至生藥量為1 g/mL(1∶1)，放冷后，備用。

工藝路線二：(水提組)稱取處方量的冰苓止癢方飲片，以8倍量水為提取溶媒，回流提取2次，每次1小時，濾過，合并濾液，濾液減壓濃縮至生藥量為1 g/mL(1∶1)，放冷后，備用。

1.5 指標性成分定量測定

1.5.1 不同提取工藝路線樣品制備 取一定處方生藥，按“1.4”項下提取并濃縮備用。

1.5.2 高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定落新婦苷、丹皮酚和升麻素苷含量

(1)HPLC色譜條件：色譜柱為INERTSIL ODS-3(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；以甲醇為流動相A，以0.1% 冰醋酸溶液為流動相B，按表1規定進行梯度洗脫；檢測波長：254 nm(升麻素苷)、291 nm(落新婦苷、丹皮酚)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。理論板數按落新婦苷峰、丹皮酚峰、升麻素苷峰計算分別應不低于5000、3000和2000。

表1 流動相梯度洗脫表

(2)對照品溶液配制：分別取落新婦苷、丹皮酚和升麻素苷對照品適量, 精密稱定, 加甲醇共同制成質量濃度分別為568.87 μg/mL、96.10 μg/mL、64.19 μg/mL的對照品溶液, 即得。

(3)樣品溶液制備：分別精密移取1 mL“2.1”項下提取液置50 mL錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

(4)樣品測定：分別精密吸取對照品溶液10 μL, 樣品溶液10 μL, 注入高效液相色譜儀, 測定, 用外標兩點法計算, 即得。計算落新婦苷含量(指標A)、丹皮酚含量(指標B)和升麻素苷含量(指標C)。

1.6 藥效學實驗

皮膚瘙癢是機體自發或受外界影響產生的一種伴隨著刮擦行為或欲望的不愉快感覺，4-氨基吡啶具有促肥大細胞釋放組胺的作用，其所致小鼠瘙癢模型已被多次應用于測定藥物止癢活性的實驗中[25]。復方醋酸地塞米松乳膏是長效甾體類激素藥物，用于局限性搔癢癥、神經性皮炎、接觸性皮炎、脂溢性皮炎以及慢性濕疹。

1.6.1 實驗動物分組 SPF級ICR小鼠30只，雌雄各半,體質量(23±2)g，飼養于北京中醫藥大學動物實驗中心，飼養環境溫度為(25±2)℃，濕度(50±10)%，適應性喂養后，雌雄各半隨機分為5組，分別為空白組、模型組、陽性藥組、醇提組、水提組。第4天在小鼠頸背部剪去2 cm×3 cm大小，再用脫毛劑脫毛，24小時后分別給藥：用藥組分別外涂冰苓止癢提取液適量于脫毛部位，模型組和空白組在脫毛區不作處理，陽性藥組外涂復方醋酸地塞米松乳膏適量。30分鐘后，每只小鼠頸背部皮下注射0.01% 4-氨基吡啶0.2 mL，空白組注射等量生理鹽水，將其置于攝像環境下的觀察籠位(50 cm×30 cm×15 cm，由隔板將其分割為6個獨立空間)，立即觀察10分鐘舔體次數(指標D)(小鼠出現反復扭頭舔兩側背部的行為，即舔體反應，以小鼠連續舔體致出現短暫停頓，作舔體1次計算)[26]。

1.6.2 制備藥物 按“2.1”項下各工藝路線制備每1 mL提取液含1 g生藥的藥物(臨床生藥濃度為0.86～1 g/mL)。

1.6.3 動物取材 小鼠的舔體次數記錄結束后立即取血，靜置至血液分層后以4000 r/分鐘的速度離心15分鐘分離血清，放置于-20 ℃保存待用，ELISA試劑盒測定小鼠血清中組胺的含量(指標E)。犧牲小鼠后，取注射部位周圍皮膚(2 cm×2 cm)全層置于4%多聚甲醛固定液中保存，做石蠟切片并進行蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)染色，觀察并比較皮膚組織有無明顯的形態學改變，觀察真皮中炎細胞的數量及形態學變化[26]。

1.7 統計學方法

1.8 數據標準化處理

數據標準化采用最小—最大標準化處理。對于指標A、B、C，若值越大，則目標值越優，新數據=(原數據-最小值)/(最大值-最小值)。對于指標D、E，若值越小，則目標值越優，新數據=(最大值-原數據)/(最大值-最小值)。

1.9 模糊層次分析法為方案層賦權

1.9.1 構造評價指標層次模型 本實驗將評價系統設計為3層，分別為目標層(1級指標，即冰苓止癢噴霧提取工藝路線篩選)、準則層(2級指標，包括化學指標和藥效學指標)和方案層(3級指標，包括落新婦苷含量、丹皮酚含量、升麻素苷含量、舔體次數和組胺濃度)。

1.9.2 構造模糊互補判斷矩陣 各指標成分的評分標度見表2。比較同一層次指標的相對重要性，構成兩兩比較模糊互補判斷矩陣。

別呦呦沒鹽了，給了我錢，讓我去買，那天逢集，人擠人，一隊胡人卻從街頭疾馳而來。胡人高舉長矛，矛尖上挑著血淋淋的首級，有一顆，有兩顆，還有人把首級掛在腰帶上。人們爭相避讓，避不及的，就被馬踢翻，后面的馬跟上來，就把他踩死了，幾十匹馬風一般掠過，死者都沒人形了。街上哭聲罵聲一片。一個老奶奶是來賣雞蛋的，一籃子雞蛋全打了，她沒哭一聲，只有一頭白發在秋風中狂舞；一個賣青菜的中年人就沒這么幸運了，他被馬踩死了，青菜被人搶光了，只有扁擔孤零零地伴著他……

表2 評分數量標度

1.9.3 構造模糊一致矩陣 根據公式(1)(2)轉變為模糊一致矩陣R’=(γij)n*n，根據得到的模糊一致矩陣和公式(3)，計算各3級指標權重，得到模糊一致矩陣。

1.9.4 一致性檢驗 若矩陣檢驗滿足任意指定兩行所對應元素之差為常數，則該矩陣為模糊一致矩陣。

2 結果

2.1 HPLC含量測定

采用HPLC法測定指標性成分落新婦苷、丹皮酚和升麻素苷含量的結果見表3。

表3 指標性成分落新婦苷、丹皮酚和 升麻素苷含量(μg/mL，n=2)

2.2 小鼠瘙癢試驗

2.2.1 小鼠舔體次數 10分鐘內小鼠舔體次數的結果見表4。空白組、水提組、醇提組和陽性藥組與模型組相比，均能顯著降低舔體的次數，差異有統計學意義，說明4-氨基吡啶致小鼠瘙癢模型造模成功，復方土茯苓方和陽性藥對于4-氨基吡啶致小鼠瘙癢模型有一定的抑制作用，其中水提組、醇提組與陽性藥組之間相比，均無顯著性差異。

表4 不同給藥組對小鼠瘙癢舔體次數的影響

2.2.2 ELISA檢測血清中組胺含量 在4-氨基吡啶致小鼠瘙癢模型中，組胺是介導瘙癢發生的關鍵性介質，具有促肥大細胞釋放組胺的作用。如表5所示，與模型組相比，空白組小鼠血清中的組胺濃度顯著降低，說明瘙癢模型造模成功。與模型組相比，水提組、醇提組和陽性藥組小鼠血清中的組胺濃度均顯著降低，其中，醇提組的組胺濃度降低最為顯著，說明醇提組和水提組對4-氨基吡啶致小鼠瘙癢模型的血清組胺濃度均有一定的降低作用，相比于水提組，醇提組效果更優。

表5 不同給藥組對小鼠血清組胺濃度的影響

注：A 空白組；B 模型組；C 陽性藥組；D醇提組；E水提組(A、C黃色箭頭表示毛囊，紅色箭頭表示皮脂腺，黑色箭頭表示膠原纖維；B藍色箭頭代表壞死細胞，綠色箭頭代表新生血管，黑色箭頭代表炎癥細胞浸潤；D、E藍色箭頭代表壞死細胞)。

2.3 數據標準化處理

最小—最大標準化處理后的數據見表6。

表6 標準化數據

2.4 模糊層次分析法為方案層賦權

2.4.1 構造模糊互補判斷矩陣 模糊互補判斷矩陣見表7。

表7 模糊互補判斷矩陣

2.4.2 構造模糊一致矩陣 3級指標的模糊一致矩陣及權重見表8。由表8可知，權重由高到低依次為舔體次數>組胺濃度>落新婦苷含量>丹皮酚含量=升麻素苷含量。

表8 模糊一致矩陣

2.4.3 一致性檢驗 結果表明，對任意指定的2行其所對應元素之差為常數，該矩陣滿足一致性檢驗。

2.5 各因素指標合成權重的確定

將準則層與3級指標權重相乘，得到各因素相對于總評價目標的總權重，在冰苓止癢噴霧提取工藝路線篩選中，藥效學指標比化學成分含量更能代表工藝路線的有效性，故選擇藥效學指標權重為0.7，指標性成分定量測定占權重0.3。結果見表9。

表9 合成權重及排序

2.6 各工藝路線加權綜合得分及排序

結果表明工藝路線一為綜合評價優選的最佳提取工藝路線，即全方醇提。結果見表10。

表10 各工藝路線加權綜合得分及排序

3 討論

本實驗采用4-氨基吡啶誘導小鼠瘙癢模型，在化學指標上，選取與臨床療效相關的活性成分：新婦苷(君藥成分)、丹皮酚(臣藥成分)和升麻素苷(君藥成分)作為代表冰苓止癢噴霧的有效成分指標，在藥效學指標上[25]，選取小鼠舔體次數、血清組胺濃度作為篩選提取工藝路線的指標。結果表明，落新婦苷、丹皮酚和升麻素苷含量高低順序為工藝一>工藝二，而舔體次數和組胺濃度高低順序為工藝一<工藝二。基于FAHP得到的評分高低順序為工藝一>工藝二，小鼠背部皮膚病理切片結果也證實了復方土茯苓方改善皮膚炎癥的作用，綜上，確立冰苓止癢噴霧的最佳提取工藝路線為全方醇提，可見此工藝路線能最大程度發揮該方的藥效物質基礎。

美國運籌學家Saaty[27]于1977年提出層次分析法作為一種新的系統分析方法，將定性與定量分析相結合，具有易操作性、實用性和系統性等優點。相比于模糊層次分析法而言，層次分析法構建層次結構的過程較復雜，計算繁瑣；在權重的確定上，會受到評價人主觀因素的影響[28]。本實驗采用模糊層次分析法，將評價系統分為目標層、準則層、方案層，構造模糊互補判斷矩陣和模糊一致矩陣，得到權重值并求出各方案的優劣次序。這樣既考慮了主觀上的影響，又考慮到了各項指標之間的相互聯系和影響，具有一定的科學性，為來源于臨床經驗方的中藥復方制劑的提取工藝研究提供新思路與新方法。