黍稷EST-SSR 標記的開發

商春悅 ，王 蓉 ，王海崗 ，陳 凌 ，Santra Dipak K ，喬治軍 ，王瑞云 ，

（1.山西農業大學 農學院，山西 太谷 030801；2.山西農業大學農業基因資源研究中心/農業農村部黃土高原作物基因資源與種質創制重點實驗室/雜糧種質資源發掘與遺傳改良山西省重點實驗室，山西太原 030031；3.內布拉斯加大學林肯分校農藝系小宗糧豆研究與推廣中心，美國內布拉斯加州69361）

黍稷（Panicum miliaceumL.）又稱黍、稷、穄和糜，屬于禾本科黍屬的1 年生草本植物，是歷史最悠久的農作物之一[1-2]，早在新石器時代就種植黍稷作為糧食作物[3]。我國是黍稷的起源中心[4]，現主要集中在長城沿線地區。與谷子、高粱和小麥等農作物相比，黍稷具有較強的物質分配能力和水分調節能力，可以在缺水的土壤中生長，且生育期短，約為60 d，為干旱半干旱地區和邊緣地區人們提供了糧食保障[5]。黍稷的栽培技術要求不高，且抗逆性強，被廣泛種植于亞洲、非洲、歐洲等世界各地[6-14]。其中，糜子含有亞油酸、多種礦物質、維生素等營養物質，且多數蛋白質與氨基酸高于小麥、玉米及水稻[15]，在亞洲及非 洲主要用來 食用[5-6，10，16-17]；而在美國和加拿大主要用于飼鳥；此外，糜子還可以作青貯飼料，品質優于燕麥[18-19]。

黍稷的遺傳多樣性是遺傳改良的基礎，黍稷是異源四倍體（2n=4x=36），基因組復雜，分子標記是遺傳相關性評估、親緣關系鑒定和群體結構分析的有效工具，其中，SSR 標記（Simple Sequence Repeat）是一種共顯性標記，因其具有數量多、多態性豐富、分布均衡且呈中性、等位位點多、重復性好和操作簡單等優點[19-20]，在遺傳多樣性評估中最具有優勢。HU 等[20]首先利用其他物種中的SSR 標記分析中國糜子的遺傳多樣性，RAJPUT 等[21-22]利用柳枝稷、水稻、小麥、大麥和燕麥的983 個SSR 進行篩選，選擇出46 個條帶清楚，多態性好的標記。雖然得到的遺傳多樣性的水平高，但由于標記來源于其他物種，其通用性差、多態性率低。之后CHO等[23]通過構建黍稷基因組DNA 的SSR 文庫，對125 對不同基元的引物進行篩選，最終得到25 對多態性標記，多態率17.5%，多態性仍然較低。一些研究者[24-27]利用EST-SSR 分子標記分析了黍稷的遺傳多樣性，相比SSR 標記結果較好，但是數目較少。EST-SSR 標記是基于表達序列標簽開發微衛星的分子標記，多態性好、特異性強且易于檢測，在水稻、小麥、大豆、玉米等植物的標記開發和遺傳研究中得到了廣泛應用[24-25]。

黍稷是一種小宗作物，現階段對黍稷基因組的研究不足，多態性標記開發效率低，可有效利用的EST-SSR 標記少，難以用分子標記對其種質資源親緣關系和遺傳差異進行更準確的研究。本研究基于黍稷轉錄組測序結果設計開發EST-SSR 引物，通過引物分辨程度、堿基重復分布狀況和遺傳參數高低等評價，旨在開發可用于黍稷遺傳多樣性分析和指紋圖譜構建的EST-SSR 標記。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗采用6份地理來源差異較大的黍稷材料（表1），幼苗長至三葉期時取葉片，并于-80 ℃低溫保存。

表1 黍稷材料Tab.1 Detail of broomcorn millet materials

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 基于黃黍稷（00005272）與鎮原大黍稷轉錄測序結果，獲得2 301 個Unigenes，從1 000對三核苷酸重復的SSR 序列中隨機挑選114個EST-SSR 標記，利用Primer Premier 5.0 設計引物， 引物序列信息如表2 所示。

表2 多態性SSR 引物的序列及退火溫度Tab.2 Sequence of polymorphism SSR primers and annealing temperature

續表2 多態性SSR 引物的序列及退火溫度Tab.2（Continued） Sequence of polymorphism SSR primers and annealing temperature

續表2 多態性SSR 引物的序列及退火溫度Tab.2（Continued） Sequence of polymorphism SSR primers and annealing temperature

1.2.2 多態性引物篩選 采用改良CTAB 法提取黍稷材料的DNA，用NanodropND-1000 核酸濃度檢測儀檢測DNA 濃度，根據A260/A280和A260/A230值分別檢測各DNA 純度：A260/A280范圍在1.7～1.9，A260/A230＞2.0。利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 是否完整，得到完整性好、純度高的DNA 后稀釋至30～80 ng/μL 備用。PCR 擴增體系（20 μL）：2×MasterMix 10 μL、上下游引物（0.4 μmoL/L）各0.8 μL、DNA 模板1 μL 和ddH2O 7.4 μL。反應程序：94 ℃預熱4 min；94 ℃變性40 s，Tm 退火40 s，36 個循環；72 ℃產物延伸8 min。用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產物，在200 V 恒壓下，等條帶移動至底部時，關閉電源。0.1% AgNO3溶液染色10 min，倒入0.2% NaOH 溶液和4～6 mL 甲醛，在通風櫥里輕輕搖晃10～15 min 直至顯色，ddH2O清洗2 次，在LED 燈膠片觀片臺上灑上蒸餾水，拍照記錄保存結果。

1.3 數據處理

根據聚丙烯酰胺凝膠結果，判斷有無多態性，并讀取多態性條帶，有多態性記為“1”，無多態性記為“0”。利用公式Rp=∑Ib 計算標記的分辨率[26]，其中Rp 表示標記分辨率，Ib 表示等位基因信息量，Ib=1-（2×︱0.5-p︱)；p 表示等位基因出現的次數。利用軟件PowerMarker 3.25[27]和PopGen 1.32計算SSR 遺傳多樣性參數。

2 結果與分析

2.1 引物的開發及篩選

RYW187 引物對6 份黍子材料的聚丙烯凝膠電泳結果如圖1 所示。

圖1 RYW187 引物對6 份黍子材料的聚丙烯凝膠電泳結果Fig.1 Polypropylene gel electrophoresis results of RYW187 primer on 6 broomcrn millet materials

通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，在114 對引物中有43 對（RYW170-RYW212）可擴增出多態性條帶，其中RYW187 引物對6 份黍稷材料的多態性如圖1所示。

2.2 43 對EST-SSR 標記的重復類型分析

43 對多態性的引物（多態率為37.7%）有24 種堿基重復類型，依次為GCG（5）、CTC（3）、GCC（3）、TGG（3）、GGC（2）、CGT（2）、CGC（2）、CCA（2）、CGA（2）、GAC（2）、CCG（2）、CGG（2）、AGC（1）、GCT（1）、CAC（1）、TCA（1）、GCA（1）、GAG（1）、TTA（1）、GGA（1）、CCT（1）、ATC（2）、TGA（1）、GTG（1），其中，GCG 數量最多，占43 對多態性引物堿基重復的12%（圖2）。

圖2 多態性引物比例及三堿基重復SSR 類型分布Fig.2 Proportion of polymorphic primers and distribution of trinucleotide repeat SSR types

2.3 43 對引物基元的Rp 值分析

從表3 可以看出，三堿基重復引物的等位基因大 小 為50～500 bp，條 帶 數 為5（RYW206）～20（RYW174）條。RYW174 的等位基因條帶最多（20 條），位點范圍為50～500 bp；RYW206 的等位基因條帶最少（5 條），位點范圍為100～250 bp，Rp值為1.00（RYW199 和RYW205）～3.00（RYW176、RYW178 和RYW179），平 均 為2.09；-----Rp 值為0.33（RYW205）～1.00（RYW176、RYW178和RYW179），平 均 為0.74，其 中RYW205 的Rp 值 與-----Rp 值 均最低。

表3 多態性SSR 引物分辨率Tab.3 Primer resolving power of polymorphic SSR

43 個SSR 標記的分布頻次中，可以看出Rp 值在0～1.0、1.0～1.5、1.5～2.0、2.0～2.5 和2.5～3.0時，分別包含2（4.65%）、6（13.95%）、11（25.58%）、15（34.88%）和9（20.93%）個標記，其中在2.0～2.5 標記頻次最多，在0～1.0 標記頻次最少。

續表3 多態性SSR 引物分辨率Tab.3（Continued） Primer resolving power of polymorphic SSR

2.4 EST-SSR 標記的遺傳參數分析

從表4 可以看出，43 對引物的觀測等位基因數（Na）為2～3 個（平均2.744 2 個），其中11 個位點產生了2 個變異，32 個位點產生了3 個變異；有效等位基因數（Ne）為1.851 9～2.941 2（平均2.401 1）。43對引物的多樣性指數（I）為0.562 3～1.098 6（平均0.916 0），觀測雜合度（Ho）為0.166 7～1.000 0（平均0.549 2），期望雜合度（He）為0.428 6～0.750 0（平均0.632 1），Nei′s 期望雜合度（Nei）為0.375 0～0.666 7（平均0.566 5），多態性信息含量（PIC）為0.239 2～0.810 2（平均0.625 2）。可以看出，RYW176 的遺傳多態性最豐富，RYW199 和RYW206 遺傳多態性最低。

表4 三核苷酸重復多態性SSR 的遺傳參數Tab.4 Genetic parameters of trinucleotide repeat polymorphism SSR

續表4 三核苷酸重復多態性SSR 的遺傳參數Tab.4（Continued） Genetic parameters of trinucleotide repeat polymorphism SSR

3 討論

3.1 EST-SSR 標記的通用性

SSR 分子標記是以擴增片段的長度變異作為多態性的共顯性分子標記，而EST-SSR 標記是由于微衛星序列重復的長度及數目變化極其豐富，較SSR 標記的多態性好、特異性強且易于檢測，已廣泛應用于植物各水平遺傳多樣性、分子系統學、品種和純度鑒定、基因定位、遺傳圖譜構建、比較基因組學等方面研究[5]。本研究基于黍稷的轉錄組數據，設計了114 對EST-SSR 引物，具有多態性的引物為43對，即多態率為37.7%，高于王銀月[28]、JIANG[26]開發的EST-SSR 引物多態性（分別為6.7% 和12.5%），但略低于何杰麗等[27]研究的EST-SSR 引物多態性（40%），其原因可能與本研究選取的標記均為三核苷酸重復標記，以及黍稷材料的來源與前人研究不同有關。但整體來看，所篩選的多態性EST-SSR 引物是基于黍稷的轉錄組數據，且多態性達37.7%，可以用于研究黍稷材料的多樣性分析。

3.2 EST-SSR 標記的多態性

SSR 標記的分辨率Rp 值可以反映引物對有效等位基因的分辨力，即衡量遺傳多樣性。Rp 值越高，表明遺傳多樣性越豐富。本研究發現Rp 值介于1.00～3.00，平均為2.09，與RAJPUT 等[22]、薛延桃等[29]和王璐琳等[30]研究發現，黍稷引物Rp 值分別為0.25～14.75（平均為2.71）、0.334～4.002（平均為1.51）和0.333～2.333（平均為1.059）研究結果基本一致。王璐琳等[30]、劉笑瑜等[31]、連帥等[32]、薛延桃等[29]和寇淑君等[33]的研究發現，基因多樣性指數（I）分 別 為0.490 2、0.627 5、0.628 4、0.770 8 和0.847 8；PIC 值 分 別 為0.432 1、0.472 3、0.485 5、0.554 4和0.587 4。本研究結果多樣性指數（0.916 0）及PIC 值（0.625 2）均高于上述研究，一方面可能由于本試驗供試材料選擇的有關引物多態性高，同時參試材料種類少，遺傳多樣性可能不夠豐富；另一方面可能由于所用的檢測方法分辨率更高，準確性更好。這也表明對已開發的黍稷EST-SSR 標記進行進一步篩選的必要性，應篩選高多態性引物用于黍稷遺傳多樣性研究和DNA 指紋圖譜的構建。此外，建立高分辨率且成本較低的分子標記檢測方法，對于促進黍稷遺傳多樣性研究也具有非常重要的意義。

4 結論

本研究從黍稷轉錄組測序得到的SSR 序列中設計了114 對三堿基重復引物，利用6 份地理來源差異較大的黍稷材料進行多態性篩選，114 對引物中擴增出43 對多態性引物，多態率為37.7%，Rp 值介于1.00～3.00（平均2.09），多樣性指數和多態性信息含量的均值分別為0.916 0 和0.625 2，說明43 對引物為高度多態性引物，可以用于栽培黍稷的指紋圖譜構建和種質遺傳多樣性分析。