寧夏野生甘草和種植甘草內生菌的分離和初鑒定

張 燃，李 佳 (.寧夏職業技術學院，寧夏銀川 7500；.阿拉善盟生態環境綜合服務中心，內蒙古阿拉善盟 750300)

甘草()，豆科甘草屬灌木狀多年生草本植物，是我國干旱、半干旱地區重要的植物資源，寧夏、甘肅、內蒙古等地為其主產區，具有耐旱、耐鹽堿、防風固沙等特點，可以產生較好的生態效益。同時甘草作為我國重要的大宗藥材，具有補脾益氣、清熱解毒、 祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥、抗癌抗病毒等作用，在臨床上用于治療呼吸系統、消化系統、免疫系統等疾病。此外，甘草還廣泛應用于食品、化工等工業中。因此，優質甘草在國內外需求量極大，市場供不應求。隨著近年來對于野生甘草資源毫無節制的采挖，資源總量和質量逐年下降，野生甘草資源已接近枯竭。而人工栽培甘草的周期長、難度大，且藥用成分如甘草黃酮、甘草酸等含量都較低。因此探索如何提高人工種植甘草質量則成為間接保護野生甘草資源、保障甘草市場需求的方法之一。

植物內生菌是指一類共生于植物體內，而不使宿主植物表現出明顯感染癥狀或產生負向影響的微生物。藥用植物中也含有大量的內生菌，研究表明一些內生菌可與藥用植物進行基因融合，使其具有可以合成與宿主相同藥效物質的能力；有些內生菌也可協助植物共同完成一些生物的合成，使中藥材中藥用成分含量增加。甘草中也有非常豐富的內生菌資源，其中以從根中分離的菌株為主。從野生優質甘草中分離其內生菌，并摸清內生菌和甘草間的相互作用、內生菌和甘草藥用成分間的關系，都將為提高種植甘草的藥用品質提供新思路，同時也將為野生甘草的保護、解決其資源匱乏等問題提供新途徑。

1 材料與方法

試材。試驗用種植甘草植株采自寧夏鹽池甘草種植基地，試驗用野生甘草植株采自寧夏鹽池金馬村，并由寧夏中藥材研究中心郭紅艷教授鑒定為烏拉爾甘草(Fisch.)。

培養基。

牛肉膏蛋白胨(BPDA)培養基。牛肉膏 3 g、蛋白胨 10 g、氯化鈉5 g，加蒸餾水熱攪拌至全部溶解后，加入瓊脂 20 g，調 節 pH 至 7.3～7.6，補加蒸餾水定容至 1 000 mL，高壓蒸汽滅菌后倒平板，每個培養皿約 15 mL，放置冷卻凝固，無菌觀察，備用。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。將馬鈴薯去皮，取 200 g，切成小塊放入加 1 L 水中，加熱煮沸 30 min，用四層紗布過濾，加入 20 g 葡萄糖、5 g氯化鈉、20 g 瓊脂，溶液再加熱煮至瓊脂全部溶解，補加蒸餾水定容至 1 000 mL，調 節 pH 至 7.0～7.4，高壓蒸汽滅菌后，加適量氯霉素倒平板，每個培養皿約 15 mL，放置冷卻凝固，無菌觀察，備用。

甘草處理。2種甘草樣本各取一截根部外表無破損的部分，約5 cm，用自來水將甘草表面泥土沖洗干凈，放入超凈工作臺紫外照射殺菌30 min，之后用75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗5次；3%次氯酸鈉浸泡2 min，無菌水沖洗5次；75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗5次。

內生菌分離培養。以無菌濾紙片吸干甘草樣品表面水分并剝去甘草根部外皮，再用滅菌的手術剪刀將樣品沿甘草根部橫截面剪切成2～3 mm厚的薄片，接種于已制備好的2種固體培養基上，每個培養皿中接3～4塊，并標記好，每個樣本 10皿。將接種植株組織的培養基用封口膜封好，放置于智能光照培養箱培養，28 ℃恒溫培養，BPDA培養基培養2～3 d，PDA培養基培養3～5 d。同時設置空白對照組，即將剝去外皮的甘草根部組織塊在空白的培養基上滾動并輕輕按壓，使樣品表面各處都接觸到培養基，再用封口膜封口，與接種好的培養皿在相同條件下一起培養，若對照組培養皿上未長出菌落，說明植株的表面消毒徹底。培養完成后，分別計算2種甘草的分離率和定殖率，其中分離率為從樣本組織塊中得到的菌株數與全部樣本組織塊數的比值，定殖率為樣本中受內生真菌侵染的組織塊數占全部樣本組織塊數的百分數。

內生菌的純化。培養完成后，觀察2種培養基的空白對照組和樣品組，若空白對照組無菌落產生，而樣品組有菌落產生，則利用接種環挑取邊緣菌落，用劃線法接入新鮮的培養基中，于 28 ℃繼續培養，待長出新菌落后，根據菌種的形態與顏色的不同，再次挑取尖端菌絲進行純化，反復純化至單一菌種。

甘草內生菌形態學鑒定。參照《常見細菌系統鑒定手冊》、《伯杰細菌鑒定手冊》、《真菌鑒定手冊》，根據內生菌菌落的表面形態、潤澤、大小、邊緣形態、顏色、質地、生長速度等特征，光學顯微鏡觀察菌絲顏色、有無產孢、孢子形態、產孢結構、有無橫隔等微觀特征，并進行形態學初步鑒定。

2 結果與分析

在接種的樣品中，從野生組分離得到12株甘草內生菌，其中內生真菌8株、內生細菌4株，從人工種植組中分離得到4株，其中內生真菌2株、內生細菌2株，分離率、定殖率見表1，部分菌種見圖1。從結果可以看出，野生組所獲得的內生菌數量明顯高于人工種植組，其中內生真菌數量高于內生細菌的數量，并且整體來看，分離獲得的甘草內生菌數量并不多。

表1 甘草內生菌的分離率、定殖率Table 1 Isolation rate and colonization rate of endophyte licorice %

圖1 甘草樣本中分離的部分菌種和空白對照Fig.1 Part of bacteria isolated from Glyeyrrhica uralensis samples and blank control

分離出來的甘草內生菌經過純化培養獲得單一菌株，部分菌落見圖2，其菌落特點見表2，參照《常見細菌系統鑒定手冊》《伯杰細菌鑒定手冊》《真菌鑒定手冊》對分離獲得的內生菌進行初步形態學鑒定，從野生甘草樣本中分離出的8株甘草內生真菌分別為青霉屬2株，占25.0%；根霉屬2 株，占25.0%；木霉屬1 株，占12.5%；鐮孢屬3 株，占 37.5%，鐮孢屬是優勢種屬；4株甘草內生細菌均屬于芽孢桿菌屬，但分別屬于萎縮芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌。從種植甘草樣本中分離出的2株甘草內生真菌分別為根霉屬1株，占50.0%；鐮孢屬1株，占50.0%，分離獲得內生真菌太少，無法分析其優勢種屬；2株甘草內生細菌均屬于芽孢桿菌屬。

3 討論與結論

此次試驗中分離純化出的甘草內生菌數量較少，不夠理想，分析推測其原因首先是甘草樣本表面消毒條件較高(紫外照射殺菌30 min，之后用 75% 乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗5次；3%次氯酸鈉浸泡 2 min，無菌水沖洗5次；75% 乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗5次)，無論是乙醇還是次氯酸鈉溶液對于甘草樣本的滲透作用都較強，因此會將甘草樣本淺表部分的內生菌殺死，導致樣本中的內生菌數量減少，影響最終分離的結果；其次在試驗初期的2次分離培養過程中都出現了空白對照陽性的情況，導致需反復對甘草表面的消毒條件進行摸索改良，錯過分離甘草內生菌的最佳時期，樣本中部分內生菌出現死亡，移植的樣本中內生菌數較少；最后此次試驗所采甘草樣本中野生甘草約3年生，種植甘草約2.5年生，因此推測由于樣本生長年限較短，本身也未曾共生太多內生菌，基于以上原因，最終培養獲得的甘草內生菌數量較少。

圖2 純化后部分甘草內生菌菌落形態及顯微形態Fig.2 Colony morphology and microscopic morphology of some Glyeyrrhica uralensis endophytes after purification

表2 純化后部分甘草內生菌的菌落特點

雖然獲得的內生菌數量較少，但從數據上也可看出明顯特點，從野生組分離獲得的內生菌不論是數量還是多樣性方面都明顯高于種植組，這與多數相關研究一致，同時也可更好地印證在藥用植物中大量且多樣的內生菌確實會直接或間接地影響其共生植物藥材的藥物作用和效果。此外還有研究表明，某些內生菌群為宿主植物適應特殊的生境提供極大的幫助，能增強或賦予宿主藥用植物抗病、抗旱、抗寒、抗鹽堿等特性賦予道地藥材較好的抗逆性品質。因此后續會繼續研究分離出來的內生菌與甘草的相互作用，以期通過對分離培養的內生菌進行篩選，來獲得可以產生甘草有效成分的內生菌，為提高種植甘草的藥用品質、解決野生甘草資源匱乏和保護等問題提供支持。