武曉陽，楊亞洲，隆文杰，陳 丹，周國雁，杜 娟，伍少云，蔡 青*，黃興奇

(1.云南大學生命科學學院，云南昆明 650091；2.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所，云南昆明 650223；3.中國種子集團有限公司生命科學技術中心，湖北武漢 430206)

糯玉米(L.var.Kulesh)是一類主要的鮮食玉米。糯玉米籽粒胚乳中的淀粉全部為支鏈淀粉，使得籽粒具有糯性口感。糯性受隱性的單基因控制。普通玉米基因能正常表達GBSSⅠ(Granule-Bound Starch Synthase Ⅰ)蛋白，用于直鏈淀粉的合成。的突變造成GBSSⅠ蛋白失去活性，直鏈淀粉的合成受阻，使玉米籽粒中的淀粉幾乎全為支鏈淀粉，產生出籽粒的糯性。玉米基因位于第9號染色體上，全長約4.5 kb，包含有14個外顯子。

糯玉米起源于我國，我國擁有豐富的糯玉米地方品種，大量的等位變異也存在其中，主要等位基因類型包括-7、-10、-4、-124、-、-、-、-和-2等類型。-7、-10是序列缺失造成的突變；-4、-124、-、-、-、-和-2是玉米基因組中轉座子活動造成的突變。其中-124是由MITE類轉座子“124”插入基因的第六外顯子造成的突變。

轉座子插入是造成基因突變的主要原因之一。轉座子是基因組中一段可移動的DNA序列，可以通過切割、重新整合等一系列過程從基因組的一個位置“跳躍”到另一個位置。根據轉座子在基因組內跳躍媒介的不同，可以將轉座子分為DNA轉座子和RNA轉座子，RNA轉座子又叫反轉錄轉座子。RNA轉座子通過“復制—粘貼”的方式轉座，DNA轉座子通過“剪切—粘貼”的方式轉座。微型反向重復轉座元件(miniature inverted-repeat transposable element，MITE)是一類主要的DNA轉座子，TITE轉座子通常具有靶位點重復(target site duplications，TSDs)和末端反向重復(Terminal Inverted Repeats，TIRs)的序列結構，根據這些特征其進一步可以劃分成1、、、、、和等家族類型。“124”是在基因突變研究中，鑒定出的一個新的MITE類轉座子家族。

云南及其周邊地區是我國少數民族的聚集地，自古以來就有食用糯性食物的習慣。很多特殊類型的糯性玉米就是在這一地區發現。“四路糯”就是其中之一，最早在云南勐海的傣族居民區發現，其果穗具有四路籽粒，形態具有許多玉米原始特征，即分蘗多、果穗多、穗行數少等，并具有獨特的口感。“勐海四路”玉米已經用于許多科學研究中。通過對基因的鑒定，發現勐海四路是-10類型的突變；通過“四路糯”玉米穗行數QTL的定位，鑒定出多個控制穗行數的主效QTL位點；“勐海四路”基因組重測序的完成，為“四路糯”的研究提供了基礎數據。由此可見，“四路糯”已成為玉米遺傳育種及相關基礎學科的特異研究材料，收集保護好這一珍貴的我國古老地方品種具有重要意義。云南省農業科學院作物種質資源庫經過多年的考察收集，保存了云南不同地區的四路糯玉米資源。筆者對來自中緬邊境地區的四路糯進行了基因組的重測序，通過與普通玉米B73基因組中“124”轉座子進行比較，探討了四路糯與普通玉米之間的親緣關系。

1 材料與方法

以糯玉米地方品種四路糯為研究材料，用于其基因組的重測序。試驗材料由云南省農業科學院種質資源庫收集保存。

對四路糯中隨機選取的3個單株分別進行了基因組的重測序。樣品DNA提取參考文獻[23]，檢驗合格的DNA樣品通過Covaris破碎機隨機打斷成長度為350 bp的片段。采用TruSeq Library Construction Kit 試劑盒進行建庫。文庫構建完成后，先使用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期后，使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量，使文庫有效濃度大于2 nmol/L，以保證文庫質量。庫檢合格，根據文庫的有效濃度及數據產出需求進行 illumina HiSeq 雙向測序。獲得原始測序序列(sequenced reads)后，進行接頭序列及polyN，polyA 等序列的過濾，將過濾后的valid reads測序數據用于進一步分析。

使用玉米自交系B73的基因組序列(http：//ftp.maizesequence.org/current/assembly/)，建立本地Blast數據庫。使用-124中的“124”序列比對B73基因組，采用Blastn程度確定“124”的插入位點，提取插入位點上下游150 bp的序列，用于分析“124”的結構。

根據“124”的結構特征編寫Perl代碼(圖1)，提取測序結果中具有“124”結構的Read序列；使用獲得的Read序列建立本地Blast數據庫；利用Blastn程序進一步確定含有“124”轉座子的Read序列；利用這些Read序列分析其中的“124”結構；根據“124”序列插入位點信息和剔除其中的重復。

使用RNAstructure 6.2軟件預測轉座子“124”的二級結構；使用軟件CLUSTAL W和Genedoc進行序列比對；使用MEGA 5軟件構建最大似然樹(Maximum Likelihood Tree)。植物MITE數據庫(Plant MITE Database，http：∥pmite.hzau.edu.cn/)用于 “124”轉座子家族的劃分。

2 結果與分析

“124”家族的轉座子最早在基因中鑒定出。通過與數據庫中已知的MITE比對，未發現相似轉座子，由此可知“124”為新鑒定出的轉座子家族。該研究使用這一序列與B73基因組進行比對，進一步鑒定出13個“124”家族轉座子的插入位點，利用轉座子上下游150 bp的序列進一步分析出每個轉座子的結構，將這些序列命名為73-124-1～73-124-13(表1)。“124”在玉米基因組中是一類低拷貝數的轉座子家族。典型的“124”轉座子全長116 bp；具有9 bp靶位點的重復序列(TSDs)，但這一結構的序列并不保守；具有保守的3 bp末端反向互補重復序列(TIRs)5′-GGA-3′和5′-TCC-3′；轉座子序列內部存在多處5′-GGA-3′和5′-TCC-3′序列，存在進一步截短的趨勢，最短的“124”序列僅73 bp；“124”轉座子可形成明顯的二級結構(圖2)，“124”家族成員的序列存在一定的相似性，但相似程度不高。值得注意的是，-124中的“124”序列與73-124-1的序列完全一致，但二者的靶位點TSDs結構并不相同。

表1 B73基因組中的“124”轉座子Table 1 The “124” transposon in B73 genome

該研究對四路糯進行了基因組的重測序，序列信息見表2。數據總量121.98 Gb。每個“124”的插入位點包括轉座子序列長度為116 bp，TSDs長度為18 bp，小于重測序的Read序列長度為150 bp，因此可以根據“124”的結構從測序結果中直接提取包含“124”的Read。該研究利用Perl代碼中的正則表達式描述“124”的結構，5～10 bp的TSD，加5′-GGA-3′序列，加70～120 bp的序列，加5′-TCC-3′，加TSD重復(圖1)，共計得到了1 101 959個含有類似“124”結構的Read序列，進一步將所得到的Read建立本地Blast數據庫，通過鑒定得到60個含有“124”轉座子的Read，-evalue 值設置為1e-010；剔除重復后共計得到17個“124”序列，并分析出其TSDs結構。這17個“124”序列分別命名為-124-1～-124-17(圖3)。

圖1 從測序結果中提取“124”結構Read的Perl代碼Fig.1 The Perl code of extracting “124” structure Read from the sequencing results

圖2 部分“124”轉座子展現出的二級結構Fig.2 The secondary structure of some “124” transposons

四路糯基因組中的“124”較B73基因組中的分布數目稍多；通過序列比對發現，“124”轉座子成員間序列具有相似性，但序列間并不具有一致性(圖3)；通過構建“124”的系統進化樹，可以將“124”轉座子大體分為4類不存在獨立基因組來源的類型；基因中的“124”可在二者基因組中找到完全一致的序列，歸為第一類“124”轉座子，但插入位點存在差異；二者基因組中存在3個完全一致的插入位點，圖4中箭頭所示分布在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類型轉座子中，展現出一致的“124”序列和一致的TSDs序列。

表2 四路糯基因組重測序的序列信息Table 2 Information of myanmar four-row wax genome resequencing

圖3 “124”轉座子間的序列比對Fig.3 Sequence alignment of “124” transposons

圖4 利用“124”轉座子序列構建的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed by transposon “124”

3 討論

糯玉米的中國起源目前已經受到了比較廣泛的認可。然而，對于的起源存在不同的觀點，一種觀點認為玉米起源于美洲，引入我國后經過單基因突變而產生不同類型的基因；另一種觀點認為基因是由本土玉米近源物種形成，在玉米中國本土化過程中轉播到引進的玉米中，形成了不同類型的糯玉米地方品種。第二種觀點的依據是四路糯可能是我國本土物種，可能是基因的主要來源。究其原因在于四路糯本身存在大量玉米的原始特征，并且在云南以外地區并未發現其分布，目前已知“四路糯”的基因類型是-10，也是我國糯玉米地方品種中廣泛分布的等位基因類型。然而，目前尚缺乏明顯的證據說明四路糯的起源。因此，四路糯基因組與普通玉米間的比較，對四路糯的起源與演化的研究具有重要意義。-124是在我國糯玉米地方品種中鑒定出的一類等位基因。該研究探索使用“124”轉座子的分布差異，研究四路糯基因組與普通玉米基因組間的分化，從“124”轉座子的構成來看，更傾向與四路糯與B73的基因組差異是玉米種內的差異。基因中插入的“124”序列在普通玉米B73和四路糯中均發現了與其一致的序列，由此推斷-124的形成于四路糯無必然的關系。這一結果傾向于玉米在引入我國后基因的突變產生了糯質性基因的觀點。