麝香壯骨膏中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量測定及質量評價

楊媛媛 張楠 謝志民 胡靜 曲彤 陶宏迅 陳志永

關鍵詞麝香壯骨膏;鹽酸麻黃堿;鹽酸偽麻黃堿;含量測定;質量評價

麝香壯骨膏收載于《衛生部藥品標準》和《國家食品藥品監督管理總局國家藥品標準》中，是由八角茴香、山柰、生川烏、生草烏、麻黃、白芷、蒼術、當歸、干姜9 味藥材按比例制成相對密度約為1.3 的浸膏，再加入麝香、薄荷腦、水楊酸甲酯、虎骨、硫酸軟骨素、冰片、鹽酸苯海拉明與樟腦組成的一種外用橡膠膏劑，具有鎮痛、消炎的功效，主要用于風濕痛、腰痛、關節痛等疾病的治療[1-2]。《衛生部藥品標準》中麝香壯骨膏的檢驗項目包括性狀、含膏量、耐熱性和微生物限度，《國家食品藥品監督管理總局國家藥品標準》中增加了氣相色譜測定法來測定樟腦、薄荷腦、冰片、水楊酸甲酯的含量[3]。在目前文獻報道的麝香壯骨膏的質量控制方法中，均以揮發油類成分為指標性成分，忽略了與藥效明顯相關的麻黃等藥材的質量控制[3-4]。

麻黃系麻黃科Ephedracea植物草麻黃Ephedra sinicaStapf、中麻黃Ephedra intermedia Schrenk et C.A.Mey.和木賊麻黃Ephedra equisetina Bge.的干燥草質莖[5]。麻黃辛溫走散，風濕痹病出現疼痛者皆宜用之，如由麻黃組成的麻黃加術湯、麻杏苡甘湯等為治療風濕所致周身疼痛的有效方劑[6-7]。同時，麻黃也是馮了性風濕跌打藥酒、風濕骨痛丸等治療風濕性關節炎、跌打損傷等中成藥的重要組成藥物[8-10]。現代研究表明，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿具有鎮咳平喘、發汗[11]、松弛氣管[12]、興奮中樞、降血壓[13]、降血糖[14]等藥理作用，是麻黃發揮藥效的主要成分[15]。基于麻黃在麝香壯骨膏治療風濕痛、腰痛、關節痛等疾病中的重要作用，以及麝香壯骨膏現有質量控制方法中對麻黃質量控制的缺失，本研究擬建立麝香壯骨膏中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿的高效液相色譜（HPLC）含量測定方法，并以這2 個成分含量為指標，對41 家企業生產的222 批次產品進行質量評價，為提升麝香壯骨膏質量控制及其臨床應用水平提供依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：LC-2030 型HPLC儀（日本Shimadzu 公司），BS210S 型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司），KQ-100 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

222 批次麝香壯骨膏為全國31 個省（自治區、直轄市）和新疆生產建設兵團的省級食品藥品監督管理局、食品藥品檢驗所根據2021 年國家評價性抽驗要求進行抽驗的樣品，涉及安徽、重慶、廣東、廣西、河北、河南、黑龍江、湖北、湖南、吉林、江蘇、江西、遼寧、內蒙古、山東、四川、天津、浙江18 個省份的41 家生產企業（企業編號為S1～S41）。所有企業中抽檢樣品最多的有23 批次，最少的有1 批次。樣品共有5 cm×6 cm、5 cm×7 cm、5cm×10 cm、6 cm×8 cm、6.5 cm×10.0 cm、7 cm×10 cm、9cm×12 cm等16 種規格，均為橡膠膏劑。

鹽酸麻黃堿對照品（批號171241-201809，純度100%）、鹽酸偽麻黃堿對照品（批號171237-201510，純度99.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院;鹽酸、磷酸、甲醇均為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Shimadzu Shim-pack GIS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（3 ∶ 97，V/V），流速為0.9 mL/min;柱溫為30 ℃;檢測波長為210nm;進樣量為10 μL。

2.2 供試品溶液的制備

取本品精密剪成大小相等的條狀，取210 cm2，除去蓋襯后，置于100 mL 具塞三角瓶中。精密加入溶劑（20%鹽酸溶液）50 mL，精密稱定質量后，加熱回流2 h，放冷，再次精密稱定質量，并用溶劑補足減失的質量，搖勻，濾過。棄去初濾液，精密量取續濾液25 mL，置于分液漏斗中，加濃氨試液調節溶液pH 至9～10，分別加乙醚萃取5 次（體積分別為20、20、15、15、15 mL），所得提取液依次通過鋪有無水硫酸鈉2 g 的干燥濾紙，濾液揮干。殘渣加0.01%鹽酸-甲醇溶液使其溶解，然后轉移至5 mL量瓶中，并加0.01%鹽酸-甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 混合對照品溶液和陰性樣品溶液的制備

取鹽酸麻黃堿對照品、鹽酸偽麻黃堿對照品適量，精密稱定，置于同一量瓶中，加0.01%鹽酸-甲醇溶液制成每1 mL 含鹽酸麻黃堿1.615 0 mg、鹽酸偽麻黃堿1.215 0 mg的溶液，即得混合對照品溶液。按麝香壯骨膏制劑工藝制備不加麻黃的陰性樣品，再按“2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 系統適用性試驗取“2.2”項下供試品溶液（企業編號S24，批號201015）和“2.3”項下混合對照品溶液、陰性樣品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖（圖1）。結果，理論板數按鹽酸麻黃堿峰計不低于10 000，各待測成分的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且陰性樣品溶液對測定無干擾，表明本方法的適用性較好。

2.4.2 線性關系及檢測限、定量限考察取混合對照品溶液，用0.01%鹽酸-甲醇溶液逐級稀釋成每1 mL含鹽酸麻黃堿0.930 3、2.325 6、5.814 1、19.380 2、64.600 0、129.200 0、323.000 0、1 615.000 0 μg 及含鹽酸偽麻黃堿0.700 0、1.749 9、4.374 9、14.581 5、48.600 0、97.200 0、243.000 0、1 215.000 0 μg 的系列線性工作液。取上述系列線性工作液，分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（Y）、對照品進樣量為橫坐標（X）進行線性回歸，并計算回歸方程。結果，鹽酸麻黃堿的回歸方程為Y=2 452X-3 644（r=0.999 9），鹽酸偽麻黃堿的回歸方程為Y=2 497X-3 967（r=0.999 9），其線性范圍分別為9.303 0～16 150.000 0 ng、7.000 0～12 150.000 0 ng。按“2.3”項下方法配制混合對照品溶液并逐級稀釋，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，分別將照信噪比為3 ∶ 1、10 ∶ 1 的對照品溶液的質量濃度作為檢測限和定量限。結果，鹽酸麻黃堿的檢測限為0.481 1μg/mL，定量限為1.603 8 μg/mL;鹽酸偽麻黃堿的檢測限為0.106 8 μg/mL，定量限為0.356 0 μg/mL。

2.4.3 精密度試驗取“2.4.2”項下含鹽酸麻黃堿19.380 2 ng/mL、鹽酸偽麻黃堿14.581 5 ng/mL 的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為0.55%、0.26%（n=6），表明該儀器的精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗取同一供試品溶液（企業編號S24，批號201015），分別在室溫下放置0、1、2、4、8、12、16、20、24 h 時，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。結果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為0.54%、1.03%（n=9），表明所制供試品溶液在室溫24 h內穩定。

2.4.5 重復性試驗取同一供試樣品（企業編號S24，批號201015）6 份，每份取210 cm2，除去蓋襯后，置于100mL具塞三角瓶中，按“2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，并采用外標法計算樣品中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量。結果，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量的RSD分別為1.28%、0.92%（n=6），說明方法的重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗精密稱取鹽酸麻黃堿對照品14.18 mg、鹽酸偽麻黃堿對照品9.53 mg，置于同一25mL量瓶中，加20%鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密量取混合對照品貯備液2 mL，置于100 mL量瓶中，加0.01%鹽酸-甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為加樣對照品溶液。取供試樣品（企業編號S24，批號201015）適量，剪成相等的條狀，混合均勻，分別取105 cm2 的樣品9 份，除去蓋襯后，置于100mL具塞三角瓶中，分別精密加入加樣對照品溶液3、10、20 mL，作為高、中、低濃度樣品溶液，每個濃度3 份。按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果，低、中、高濃度樣品溶液中鹽酸麻黃堿的平均加樣回收率分別為102.12%、96.54%、96.94%（RSD分別為0.55%、0.28%、1.77%，n=3），鹽酸偽麻黃堿的平均加樣回收率分別為102.46%、98.62%、99.09%（RSD分別為1.16%、1.71%、1.94%，n=3），表明方法的準確度較好。結果見表1。

2.4.7 耐用性試驗精密取同一供試樣品（企業編號S24，批號201015）適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別在不同品牌C18 柱（AgilentSTC-C18、月旭XB-C18、島津Shim-pack GIST C18、島津Shim-pack GISC18、譜寧RSZG C18，規格均為250 mm×4.6 mm×5 μm）、不同流速（0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 mL/min）、不同柱溫（20、25、30、35、40 ℃）下進樣測定（僅改變單一條件，其余條件同“2.1”項下），記錄色譜圖。結果，改變上述色譜條件后，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿均分離良好（分離度分別為2.07～9.02、1.55～3.80）、呈峰形對稱（對稱因子分別為0.71～0.98、0.76～0.96），表明方法的耐用性較好。

2.5 含量限度確定

2020 年版《中國藥典》（一部）收載的麻黃項下鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿HPLC含量測定項目規定：本品按干燥品計算含鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總量不得低于0.80%。本研究按照處方量及在該樣品制備工藝下目標成分的轉移率約為40%計算，得出本品每1 cm2含鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總量不得低于1.00 μg。

2.6 樣品含量測定

取41 家企業生產的222 批次樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并以外標法計算樣品中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿含量。結果，41 家企業生產的樣品中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總含量在0.646～6.325 μg/cm2之間，可見不同企業生產的麝香壯骨膏中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總含量差異較大。222 批次樣品中低于擬定限度（1.00 μg/cm2）的有23 批次（其中1 批次未檢出2 種成分），合格率為89.6%[5]。大部分企業生產的不同批次麝香壯骨膏中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量差異不大，但也有少部分企業生產的產品差異較大，如編號為S7 的企業生產的不同批次產品中鹽酸麻黃堿（0.269～1.723 μg/cm2）、鹽酸偽麻黃堿（0.324～0.966 μg/cm2）的含量波動范圍較大。含量測定結果見表2。

2.7 聚類熱圖分析

聚類熱圖可對實驗數據分布情況進行直觀可視化分析。將222 批次麝香壯骨膏中鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿及兩者含量之和的均值導入Hiplot生物醫學數據可視化和分析平臺（https：//hiplot.com.cn/），聚類方法選擇“ward”法，設置距離度量為“euclidean”，得到聚類熱圖（圖2），圖中從藍到紅代表含量由低到高。由圖2 可見，41 家企業生產的222 批次樣品可聚為3 類：S6、S7、S9、S11、S14、S16、S18～S22、S24、S27、S28、S32、S36、S38 這17 家企業生產的樣品被聚為第1 類，此類樣品中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量均較低;S1、S3～S5、S12、S13、S15、S23、S26、S31、S33、S35、S37、S39、S41 這15 家企業生產的樣品被聚為第2 類，此類樣品中鹽酸麻黃堿的含量較高;其他企業生產的樣品被聚為第3 類，此類樣品中鹽酸偽麻黃堿的含量較高。鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量之和較高的樣品生產企業主要分布在湖北（S12、S13、S15）、江蘇（S26）、山東（S33）、安徽（S1）、吉林（S23）、廣西（S4）、天津（S37）、遼寧（S31）、四川（S35）、廣東（S3）、浙江（S39）、重慶（S41）、河北（S5）。由上述結果可見，41 家企業生產的麝香壯骨膏質量基本穩定，并無明顯的地域差異。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

由于麝香壯骨膏為貼膏劑，研究初期筆者考察了不同的提取溶劑（乙醚、甲醇、乙腈、鹽酸溶液）對實驗的影響。結果顯示，直接用有機溶劑提取會將橡膠基質一并溶解，很難通過離心、萃取、過膜等方法將有效成分洗脫出來。后改為采用一定體積分數的鹽酸溶液提取，所得提取液澄清，無基質干擾。由于貼膏劑載藥量有限，為了較大限度地提取出待測成分，筆者比較了不同提取方式（超聲、回流）的提取效果。結果表明，回流提取的效果優于超聲提取，故筆者最終采用回流提取法進行樣品提取。在確定了提取方式后，筆者又分別對鹽酸的體積分數（20%、25%、30%）、回流提取時間（1、2、3 h）、乙醚萃取次數（3、4、5 次）進行了正交實驗篩選，最終根據優選出的最佳條件確定了本研究的提取方法。

3.2 色譜條件的選擇

2020 年版《中國藥典》（一部）麻黃項下含量測定的HPLC方法中，是以極性溶劑乙醚連接苯基鍵合硅膠為填充劑，以甲醇-0.092%磷酸溶液（含0.04%三乙胺和0.02%二正丁胺）（1.5 ∶98.5，V/V）為流動相，檢測波長為210 nm[5]。為了提高檢測方法的普適性，并減少檢測成本，本研究經過反復的預實驗，確定使用C18 常規色譜柱，以0.1%磷酸溶液作為流動相水相。本研究所用方法降低了藥典中分析方法的復雜性，同時避免了三乙胺對色譜柱造成的不可逆損害。系統適用性試驗結果顯示，本研究所建含量測定方法在不同品牌C18柱（規格均為250 mm×4.6 mm×5 μm）、不同流速（0.7～1.1 mL/min）、不同柱溫（20～40 ℃）下，鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿均可得到較好分離，峰形對稱，提示本方法可用于麝香壯骨膏中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量測定。

3.3 制備工藝分析

由于麝香壯骨膏法定標準對中藥浸膏的制備工藝描述過于簡單，導致各生產企業的制備工藝差異較大，如本研究涉及的41 家企業中采用浸漬法提取的有2 家，采用滲漉法提取的有6 家，采用回流法提取的有33 家。因浸漬法和滲漉法的提取方式較接近，且采用的企業較少，故本研究將這2 種方法合并討論。研究結果顯示，采用回流方法制備的麝香壯骨膏中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的平均含量（3.030 μg/cm2）均明顯高于浸漬法+滲漉法（2.623 μg/cm2），且含量的RSD（55.37%）明顯小于浸漬法+滲漉法（66.63%），這表明浸膏的制備工藝對產品中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量影響較大。

綜上所述，本研究建立了麝香壯骨膏中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量測定方法，該方法準確、精密，對原有質控方法進行了補充。本研究通過對41 家企業生產的222 批次樣品進行含量測定，并引入聚類熱圖分析后發現，不同企業生產的麝香壯骨膏中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的總量差異較大，這可能是由于企業間生產設備的差異及生產工藝控制不夠等問題導致的。部分企業生產的不同批次麝香壯骨膏中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量差異較大，這提示相關企業應優化生產工藝，加強藥材質量控制與生產過程質量控制。