白菜bZIP轉錄因子基因家族應答春化反應關鍵基因表達分析

馬李廣 張賀龍 龐小可 王浩 李廣 汪承剛 袁凌云 侯金鋒 唐小燕 陳國戶

摘要： 為研究白菜（ Brassica rapa ）堿性亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper，bZIP）轉錄因子家族基因（ BrbZIP ）的相關功能，通過生物信息學分析技術，鑒定全基因組的 BrbZIP 基因家族成員，并對其染色體分布、進化關系、表達模式及其應答春化反應等進行了分析。白菜bZIP轉錄因子基因家族共有118個成員，在染色體上不均等分布。白菜組織轉錄組分析結果顯示，大部分 BrbZIP 基因在根、莖、葉、花及莢中均有較高的表達豐度，且具有組織表達特異性;春化反應轉錄組、熒光定量PCR及相關基因互作網絡分析結果表明，白菜 bZIP 基因家族中應答春化反應相關基因上調與下調表達基因數量差異不大，相互之間存在復雜的互作網絡，其中4個成員（Bra039631、Bra020620、Bra004550與Bra020471）是應答春化反應的中心節點。

關鍵詞： 白菜; bZIP轉錄因子; 基因家族; 春化反應; 生物信息學分析

中圖分類號： S634.3?? 文獻標識碼： A?? 文章編號： 1000-4440（2022）03-0765-10

Genome-wide identification of bZIP transcription factor gene family in ?Brassica rapa ?and its association with vernalization

MA Li-guang 1 ， ZHANG He-long 1 ， PANG Xiao-ke 1 ， WANG Hao 1 ， LI Guang 1，2 ， WANG Cheng-gang 1，2，3 ，YUAN Ling-yun 1，2 ， HOU Jin-feng 1，2 ， TANG Xiao-yan 1，2 ， CHEN Guo-hu 1，2，3

（1.Anhui Provincial Engineering Laboratory of Horticultural Crop Breeding， School of Horticulture， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China; 2.Wanjiang Vegetable Industrial Technology Institute， Maanshan 238200， China; 3.Anhui Southwest Comprehensive Experimental Station of Anhui Agricultural University， Huaining 246100， China）

Abstract： In order to explore the function of basic leucine zipper （bZIP） transcription factor in ?Brassica rapa ?and its association with vernalization， bioinformation methods were used to identify the ?B. rapa ?bZIP gene family members. The chromosome location， evolutionary relationship， expression pattern and vernalization response were analyzed through a variety of biological information softwares. The results revealed that 118 ?BrbZIP ?transcription factors were unevenly distributed on the chromosomes of ?B. rapa . Transcriptome analysis showed that most of the ?BrbZIP ?genes had high expression levels in roots， stems， leaves， flowers and pods， and had tissue expression specificity. The results of transcriptome， fluorescence quantitative PCR and interaction network analysis suggested that there was n o significant difference in the number of up-regulated an d down-regulated genes responding to vernalization in bZIP gene family of ?B. rapa ， and the interaction network was complex. Four ?BrbZIP ?genes were the central nodes in response to vernalization.

Key words： ?Brassica rapa ; bZIP transcription factor; gene family; vernalization; bioinformatics analysis

轉錄因子（Transcription factors，TFs），是一類通過與下游基因啟動子順式元件特異性結合或與其他蛋白質互作來調控基因表達的一類蛋白質。在只存在于真核生物中的轉錄因子家族中，堿性亮氨酸拉鏈（Basic leucine zipper，bZIP）家族是轉錄因子中成員數量最多、最保守的家族之一，在植物生長發育和應答脅迫反應等生物過程中起著重要的調控作用 [1] 。

bZIP蛋白最顯著的特征是含有一個保守的60～ 80個氨基酸組成的bZIP結構域（ N -×7-R/K-×9- L -×6- L ），包括1個堿性氨基酸區域和1個相鄰的亮氨酸拉鏈區;堿性氨基酸區域位于C端，由16～20個氨基酸殘基組成 N -×7-R/K基序，負責與DNA啟動子區域內特定序列結合;亮氨酸（Leu）拉鏈區位于 N 端，由亮氨酸或異亮氨酸（Ile）、纈氨酸（Val）組成的七肽重復序列（×9- L -×6- L -×6- L ），主要作用為bZIP蛋白特定識別和形成同源二聚體 [2] 。植物bZIP蛋白優先與含有ACGT核心元件的DNA序列結合，特別是G-box（CACGTG）、C-box（GACGTC）以及A-box（TACGTA）等元件 [3] 。

目前bZIP轉錄因子基因家族已在多個植物基因組中被鑒定出來，如擬南芥（ Arabidopsis thaliana ） [4] 、油菜（ B.napus ） [5] 、麻瘋樹（ Jatropha curcas ） [6] 、藜麥（ Chenopodium quinoa ） [7] 、楊樹（ Populus tremula ） [8] 、獼猴桃（ Actinidia chinensis ） [9] 等。大量研究結果表明，bZIP轉錄因子在植物光信號、花的誘導與發育、種子成熟與萌發、非生物和生物脅迫等多個關鍵生物學過程中起著重要的作用。例如，在擬南芥中，bZIP11基因可影響根系發育 [10] ，HY5基因參與調控根和下胚軸的發育 [11] ;而bZIP1基因與花藥發育過程中的水分運動密切相關，其過量表達不利于花粉發育 [12] 。小麥（ Triticum aestivum ）bZIP轉錄因子 TaGBF 基因調控 CO 及 FT 等基因的表達，影響植物開花 [13] 。大豆（ Glycine max ）植株中FDL19蛋白與FT2a、FT5a相互作用，可影響大豆的開花時間 [14-15] 。風疹卷尾草（ Capsella rubella ）TGA4基因的過表達，可延遲擬南芥開花時間 [16] 。編碼bZIP轉錄因子的HY5基因，在植物幼苗光形態建成期間，對激活光反應基因起著重要的作用 [17] 。水稻（ Oryza sativa ）應激激活蛋白激酶SAPK100磷酸化OsbZIP77，導致開花時間提前 [18] ;OsFD4基因通過作用于莖尖分生組織中成花整合因子復合物的形成，促進水稻開花 [19] 。因此，bZIP轉錄因子在植物開花過程中具有重要的作用。

目前，bZIP轉錄因子在植物開花過程中的功能研究，已有一些進展。然而迄今為止，未有白菜bZIP轉錄因子參與春化反應的研究報道。本研究擬對白菜（ B. rapa ） bZIP 基因家族進行系統研究，包括基因家族成員鑒定、蛋白質氨基酸序列分析和系統發育關系、基因的染色體分布、基因組串聯復制和片段復制、基因共線性分析等，此外，基于轉錄組數據及熒光定量PCR分析，探討白菜 bZIP 基因在不同組織中的表達模式及應答春化反應相關基因的表達，為進一步解析白菜 bZIP 基因在春化過程中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 數據來源

從白菜基因組數據庫（BRAD;http：//brassicadb.cn/）下載白菜全基因組數據（V1.5）及其注釋文件，從NCBI Sequence Read Archive（SRA）數據庫下載白菜不同組織（根、莖、葉、花、莢等） [20] 及春化反應（JWW材料春化0 d、25 d、35 d;XBJ材料春化0 d、10 d、25 d） [21] RNA-Seq原始數據。RNA-Seq原始數據經過質量控制過濾后，比對至白菜基因組（V1.5）序列，再利用FeatureCounts進行有參轉錄組定量?；虮磉_豐度采用FPKM值進行計算，差異表達基因采用DESeq軟件包進行計算 [22-23] 。

1.2 白菜 bZIP 基因家族成員的鑒定

從白菜基因組數據庫（BRAD）下載 bZIP 基因家族候選成員ID，利用TBtools軟件 [24] 提取白菜 bZIP 基因家族候選基因序列、蛋白質氨基酸序列等信息。使用Pfam（http：//pfam.xfam.org/）、SwissProt（https：//www.expasy.org/resources/uniprotkb-swiss-prot）、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和InterProScan（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/about/interproscan/）等數據庫鑒定所有候選蛋白質氨基酸序列。對確定BrbZIP成員的蛋白質氨基酸序列，利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法以及泊松校正與成對刪除法，構建系統進化樹 [25] 。

1.3 白菜bZIP家族理化性質及 bZIP 基因組信息分析

采用ExPasy工具（https：//web.expasy.org/compute_pi/），分析白菜bZIP家族的相對分子質量、等電點和長度等理化性質。提取白菜 bZIP 基因家族注釋信息，并定位到染色體上，利用TBtools工具進行可視化，獲得 BrbZIP 基因家族成員染色體定位圖譜。將白菜 bZIP 基因家族編碼的蛋白質氨基酸序列進行all-BLASTP-all分析（ top <5， E <1e -5 ）。采用TBtools軟件中MCScanX工具提取共線性基因對，再利用Circos工具進行可視化。

1.4 白菜 bZIP 基因家族組織表達分析及其應答春化反應分析

利用白菜不同組織轉錄組數據 [20] ，分析 BrbZIP 基因家族的組織表達特征。利用白菜春化反應材料轉錄組數據 [21] ，分析白菜 bZIP 基因家族應答春化反應。利用STRING數據庫（https：//string-db.org/）分析白菜應答春化相關 bZIP 基因互作網絡關系。對 BrbZIP 基因家族中應答春化反應關鍵基因，利用熒光定量PCR技術分析其在JWW不同春化時間材料中的相對表達量 [21] 。

2 結果與分析

2.1 白菜 bZIP 基因家族鑒定及其編碼的蛋白質理化特性分析

經篩選鑒定，在白菜基因組中共獲得118個 bZIP 基因家族成員。理化性質分析發現，白菜 bZIP 基因家族開放閱讀框（ORF）長度為273～ 1 893 ?bp，編碼90～ 630個氨基酸（AA），預測相對分子質量大小在1.062× 10 4 至6.874× 10 4 之間，等電點（pI）范圍為4.80～ 10.11。對白菜bZIP蛋白的等電點與相對分子質量之間進行比較分析，發現酸性與堿性BrbZIP蛋白數量相差不大，且相對分子質量分布較規律。對白菜bZIP蛋白進行亞細胞定位預測分析，結果顯示絕大部分白菜bZIP蛋白家族成員定位于細胞核內，只有6個成員定位于細胞膜、線粒體或葉綠體中，表明白菜bZIP蛋白家族的功能主要發生在細胞核中。

2.2 白菜 bZIP 基因家族染色體定位分析

利用白菜基因組注釋信息，將白菜 bZIP 基因家族定位于染色體上。結果如圖1所示，118個白菜 bZIP 家族基因不均等分布在10條染色體上，各染色體上的基因數量與染色體大小無關。其中，染色體A09上的 BrbZIP 基因家族數量最多（23個），染色體A10上的 BrbZIP 基因家族數量最少（7個）。此外，白菜 bZIP 家族基因在A04（Bra016959與Bra016953）、A09（Bra007274與Bra007276）染色體上各有1對基因串聯重復，表明白菜 bZIP 家族基因 在進化過程中發生了少量的串聯重復現象。

2.3 白菜與擬南芥 bZIP 基因家族系統發育分析

為了確定白菜 bZIP 基因家族成員的進化關系，通過MEGA-X軟件中MUSCLE工具將118個白菜 bZIP 基因與73個擬南芥 bZIP 基因進行序列分析比對，運用鄰接法構建了系統發育樹（圖2）。白菜與擬南芥 bZIP 基因家族分成了5個大簇（GroupA～ GroupE）、11個小簇。其中，Group E的 bZIP 基因數量最多，包括21個 AtbZIP 基因和41個 BrbZIP 基因;Group C的數量最少，僅有16個，包括7個 AtbZIP 基因和9個 BrbZIP 基因。系統發育樹分析結果表明，各簇中白菜和擬南芥 bZIP 基因具有較高的同源性。

2.4 白菜 bZIP 家族基因共線性分析

為了分析白菜 bZIP 家族基因的擴張模式，對其基因復制事件進行了分析。如圖3所示，118個白菜 bZIP 家族基因成員之間，有110對存在共線性基因對，其中存在著單個基因與多個基因對應的情況，表明白菜 bZIP 家族在發育進化過程中發生了大量的基因復制現象，是白菜 bZIP 基因多樣性的主要驅動力。

2.5 白菜 bZIP 家族基因表達模式及響應春化反應分析

為了研究白菜 bZIP 基因在不同組織中的表達模式，利用白菜組織轉錄組數據分析了 BrbZIP 基因在根、莖、葉、花、莢等組織中的表達情況。結果如圖4A所示，大部分白菜 bZIP 基因在各組織中均有表達，表明這些 bZIP 基因在白菜整個生長發育階段均有重要的作用。對 FPKM 值大于500的 BrbZIP 基因進行了維恩分析，發現各組織共有 BrbZIP 基因僅13個（圖4B）。此外，少數 BrbZIP 基因具有較強的組織表達特異性，如Bra037809、Bra018634、Bra031871、Bra023540、Bra031622等主要在根系中表達，Bra010504、Bra004329等主要在莖中表達，Bra025144主要在花中表達，而Bra009288、Bra035957等在莢中表現出較高的轉錄豐度，表明 BrbZIP 基因的表達具有組織特異性（圖4）。

我們還利用白菜春化反應轉錄組數據分析了應答春化的相關 BrbZIP 基因，結果如圖5所示，在白菜JWW材料與XBJ材料春化轉錄組數據中，共篩選出42個差異表達 BrbZIP 基因（DEGs）（圖5A），這些DEGs中，JWW材料與XBJ材料共有18個（圖5B），其中8個DEGs上調表達，10個DEGs下調表達（圖5C）。對白菜JWW材料與XBJ材料中春化相關 BrbZIP 基因分別進行表達趨勢分析發現，共有5個顯著富集趨勢（ P < 0.05）。在JWW材料中，18個 BrbZIP 基因隨春化時間延長，轉錄豐度逐漸增大，其中12個 BrbZIP 基因在春化25 d時表達量最大（Profile 6）、6個 BrbZIP 基因在春化35 d時表達量最大（Profile 7）;10個 BrbZIP 基因隨春化時間延長轉錄豐度逐漸降低（Profile 1）。在XBJ材料中，16個 BrbZIP 基因隨春化時間延長，轉錄豐度逐漸增大，在春化10 d時表達量最大（Profile 6）;7個 BrbZIP 基因隨春化時間延長轉錄豐度逐漸降低（Profile 0）。在JWW材料與XBJ材料共有模塊6（Profile 6）中，共有9個 BrbZIP 基因（圖6），表明這些 BrbZIP 基因在白菜春化反應中具有重要的作用。

2.6 白菜 bZIP 家族應答春化相關基因互作網絡分析

為了進一步研究白菜春化應答 BrbZIP 基因的相互作用，利用STRING數據庫對JWW材料與XBJ材料中共有18個應答春化 BrbZIP 基因進行互作網絡分析（圖7）。結果顯示18個 BrbZIP 基因中有11個與其他基因有相互作用關系，且互作網絡表現出復雜的相關性，其中Bra039631（AtbZIP2）、Bra020620（AtbZIP63）、Bra004550（AtbZIP55）、Bra020471（AtbZIP9）基因在互作網絡中是應答春化反應的中心節點，表明其在應答春化反應調控網絡中具有重要的作用。

2.7 白菜 bZIP 家族應答春化相關基因熒光定量PCR分析

利用熒光定量PCR技術，進一步分析白菜 bZIP 家族應答春化反應關鍵基因的表達水平。結果（圖8）顯示，在春化35 d內，Bra039631、Bra020620、Bra033464、Bra001742、Bra017316基因的表達量均低于春化前，而其他6個基因的表達水平均高于春化前。以上結果表明，上述 BrbZIP 基因為白菜春化應答基因，在白菜春化過程中具有重要的作用。

3 討 論

bZIP轉錄因子基因家族是植物中數量比較多的基因家族，不同植物家族成員數量不等，但在進化上比較保守 [3] 。本研究經過嚴格篩選鑒定，從白菜基因組中獲得118個 bZIP 基因，數量是擬南芥 bZIP 成員的1.6倍，與白菜 PRX 家族基因數量比值類似 [23] ，表明 BrbZIP 家族基因成員在白菜基因組倍化過程中，同樣發生了基因丟失事件。通過系統發育樹分析將已鑒定的白菜與擬南芥 bZIP 基因成員分為5大簇11個小簇，與擬南芥根據結構分組的結果類似 [4] ，表明白菜與擬南芥的 bZIP 基因在進化上是保守的。

在物種進化過程中，基因家族通常經歷串聯復制或大規模的片段復制，以維持家族較大規模 [8， 26] 。白菜經歷過2次全基因組復制，及1次全基因組三倍化事件 [27] 。然而，白菜118個 bZIP 基因只有2對串聯重復，數量顯著少于油菜（247個成員，15個基因復制對） [5] ，但白菜基因組內共線性基因對高達110組，表明基因復制事件在蕓薹屬作物進化中的復雜性，以及在 bZIP 基因家族擴展中的重要性 [5， 28] 。此外，通過組織表達模式分析也發現，一些重復的 BrbZIP 的轉錄水平也相似，這可能與它們高度相似的結構和順式調控元件有關。

對于多基因家族來說，基因表達分析常常為功能預測提供有用的線索。本研究利用白菜組織轉錄組數據 [20] 分析了 BrbZIP 在各組織中的表達模式。結果表明，大部分 BrbZIP 在白菜根、莖、葉、花、莢中均有較高的表達豐度，且在根組織中高表達豐度基因數量最多，這可能與根部應答逆境相關 [1] ;在各組織高表達豐度（ FPKM >500）的 BrbZIP 基因中，各組織僅共有13個 BrbZIP 基因，說明大部分 BrbZIP 基因具有組織表達特異性，且這些組成型表達 BrbZIP 基因在白菜生長發育過程中具有重要的作用 [8] 。

由于目前對 bZIP 基因應答春化反應的調控作用知之甚少，我們探討了 bZIP 基因在白菜幼苗春化反應中的表達模式。比較春化前后樣本的表達數據 [21] ，結果顯示白菜 bZIP 家族基因中應答春化反應表達有上調也有下調，結果與大麥（ Hordeum vulgare ）中類似 [29] 。在白菜兩個材料中應答春化反應 bZIP 基因有42個，共有差異表達基因18個，其中上調基因8個，下調基因10個，表明這些基因與春化反應密切相關。為了了解它們的功能，對白菜18個春化應答關鍵 bZIP 基因進行了基因互作網絡分析及熒光定量PCR分析，發現這些基因表現出較復雜的互作關系，其中下調表達基因Bra039631與Bra020620，及上調表達基因Bra004550與Bra020471作為互作網絡的中心節點，在白菜應答春化過程中發揮著重要作用。

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（責任編輯：張震林）

收稿日期：2021-09-10

基金項目：國家自然科學基金項目（31801853）;國家大學生創新創業基金項目（202110364080）;安徽省大學生創新創業基金項目（S202010364238、S202010364239）;安徽省博士后基金項目（2019B320）

作者簡介：馬李廣（2000-），男，廣東河源人，學士，研究方向為蔬菜種質資源與遺傳育種。（E-mail）1554727563@qq.com。張賀龍為共同第一作者。

通訊作者：陳國戶，（E-mail）cgh@ahau.edu.cn