槐定堿上調miR-5195-3p表達抑制宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究

李剛 張達 張建秀

宮頸癌是威脅女性健康的第二大癌癥，放射及化學治療的不良反應較大，中藥有效成分在抗腫瘤方面有著多途徑、多靶點、毒副作用小等優勢，一定程度上可延長宮頸癌患者的生存期[1,2]。因此，開發可用于抗宮頸癌中藥對其治療具有重要意義。槐定堿是從豆科槐屬植物苦豆子(sophora alopecuroides L)中提取的單體生物堿，具有顯著的抗腫瘤作用，是一種高效低毒的抗癌生物堿；有研究報道槐定堿聯合順鉑可以有效抑制卵巢癌細胞增殖，降低其惡性程度[3]。槐定堿可抑制肝癌SMMC-7721細胞增殖和促進凋亡[4]。槐定堿可抑制肺癌A549細胞體外增殖和侵襲能力[5]。槐定堿通過靶向MAPKAPK2促進細胞自噬、凋亡和周期阻滯，從而抑制結直腸癌的發生與發展[6]。然而槐定堿對宮頸癌HeLa細胞生物學行為的影響及機制尚不清楚。有研究報道miR-5195-3p可能通過阻礙EMT通路抑制宮頸癌細胞SiHa的增殖，遷移與侵襲[7]。miR-5195-3p對神經膠質瘤細胞亦具有增殖抑制作用[8]。因此，本實驗旨在探討槐定堿對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的影響及機制是否與miR-5195-3p有關。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌細胞株HeLa(上海冠導生物工程有限公司)；RPMI-1640培養基(浙江聯碩生物科技有限公司)；槐定堿(純度≥98%，江蘇永健醫藥科技有限公司)；MTT試劑盒(大連美侖生物公司)；吉薩姆染色液(上海鈺博生物科技有限公司)；Transwell小室、基質膠(美國康寧)；RIPA蛋白裂解液(上海北諾生物科技有限公司)；山羊抗兔IgG-HRP(美國GeneCopoeia)；E-cadherin抗體、N-cadherin抗體(武漢菲恩生物科技有限公司)；Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒(日本Takara)。

1.2 細胞處理與分組 宮頸癌細胞株HeLa常規培養于RPMI-1640培養基中，取對數生長期細胞，分別用濃度為1.25 g/L、2.5 g/L、5 g/L的槐定堿處理，作為槐定堿低、中、高濃度組，常規培養的細胞作為對照組；將miR-5195-3p模擬物及陰性對照轉染至HeLa細胞，記為miR-5195-3p組、miR-NC組；將miR-5195-3p抑制劑及陰性對照轉染至HeLa細胞后用5 g/L的槐定堿處理，記為槐定堿+anti-miR-5195-3p組、槐定堿+anti-miR-NC組。

1.3 MTT法檢測細胞增殖抑制率 各組細胞培養48 h按照20 μl/孔加入MTT溶液，孵育4 h后去上清，按照150 μl/孔加入二甲基亞砜，振蕩反應10 min，酶標儀測量490 nm處吸光度(OD)值。細胞增殖抑制率(%)=(1-試驗組OD值/對照組OD值)×100%。

1.4 克隆形成實驗檢測細胞克隆形成數 各組細胞制成1×104個/ml細胞懸液，取100個細胞接種6孔板，適時更換培養液，當出現肉眼可見克隆時終止培養，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2次，經甲醇固定、吉姆薩染色后，顯微鏡下計數>50個細胞的克隆數。

1.5 劃痕實驗檢測細胞劃痕愈合率 各組細胞消化后接種于培養板，過夜細胞鋪滿后用槍頭直線劃痕，用PBS沖洗劃下的細胞，換液后繼續培養，在培養0 h和24 h拍照觀察，用Image-Pro Plus 6.0軟件計算劃痕愈合率。

1.6 Transwell小室法檢測細胞侵襲 將稀釋好的基質膠包被Transwell小室上室膜，凝固后接種100 μl細胞懸液，下室加500 μl含血清培養液，37℃培養24 h，棉簽擦拭掉上層未穿過基底膜的細胞，用0.1%結晶紫染色細胞30 min，PBS漂洗2遍，風干后光學顯微鏡(×200)下隨機選擇5個視野，觀察并計數。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，煮沸5 min使蛋白變性，按照40 μg上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后濕轉到NC膜，用封閉液封閉1 h，分別加入E-cadherin、N-cadherin抗體(1∶1 000)，4℃孵育過夜；洗膜，加入山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)室溫孵育2 h，洗膜后顯影，用ChemiDoc XRS+系統成像，Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，計算蛋白相對表達水平。

1.8 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-5195-3p表達水平 提取細胞總RNA，按熒光定量PCR試劑盒配置反應體系，以U6為內參進行PCR擴增，相對表達量采用2-△△Ct法計算。miR-5195-3p上游引物序列：5’-GCCTGTAGGCATCATCGCCAG-3’，下游引物序列：5’-GATAGAGTGACGTGAAGTAG-3’；U6上游引物序列：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3’。

2 結果

2.1 槐定堿對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響 與對照組比較，槐定堿低、中、高濃度組HeLa細胞增殖抑制率升高，細胞克隆形成數減少，呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 槐定堿對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響

2.2 槐定堿對宮頸癌HeLa細胞遷移侵襲的影響 與對照組比較，槐定堿低、中、高濃度組HeLa細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數、N-cadherin蛋白表達降低，E-cadherin蛋白表達升高，呈濃度依賴性(P<0.05)。見表2，圖1。

圖1 槐定堿對宮頸癌HeLa細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響

表2 槐定堿對宮頸癌HeLa細胞遷移侵襲的影響

2.3 槐定堿對宮頸癌HeLa細胞miR-5195-3p表達的影響 與對照組比較，槐定堿低、中、高濃度組miR-5195-3p表達水平升高，呈濃度依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 槐定堿對宮頸癌HeLa細胞miR-5195-3p表達的影響

2.4 過表達miR-5195-3p對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-5195-3p組miR-5195-3p表達水平、增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達升高，劃痕愈合率、克隆形成數、侵襲細胞數、N-cadherin蛋白表達降低(P<0.05)。見圖2，表4。

圖2 過表達miR-5195-3p對宮頸癌HeLa細胞遷移侵襲相關蛋白表達的影響

表4 過表達miR-5195-3p對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.5 干擾miR-5195-3p表達逆轉了槐定堿(5 g/L)對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與槐定堿+anti-miR-NC組比較，槐定堿+anti-miR-5195-3p組miR-5195-3p表達水平、增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達降低，劃痕愈合率、克隆形成數、侵襲細胞數、N-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 干擾miR-5195-3p表達逆轉了槐定堿對宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的作用

圖3 干擾miR-5195-3p表達逆轉了槐定堿對宮頸癌HeLa細胞遷移侵襲相關蛋白表達的作用

3 討論

中藥具有良好的抗腫瘤活性，中藥生物堿類成分是近年來研究的熱點，在治療惡性腫瘤方面有著較大的優勢[9]。槐定堿是生物堿的一種，研究報道槐定堿通過激活P53和Hippo信號通路抑制肺癌細胞生長并增強順鉑敏感性[10]。槐定堿能顯著抑制人膠質瘤U87MG細胞、胰腺癌細胞capan-1增殖，誘導細胞凋亡[11,12]。槐定堿可能通過下調HMGB3抑制人胃癌MKN45細胞的增殖，促進其凋亡[13]。為研究槐定堿對宮頸癌HeLa細胞的影響，本實驗用不同濃度槐定堿處理HeLa細胞，結果顯示，HeLa細胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達升高，細胞克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲細胞數、N-cadherin蛋白表達降低，呈濃度依賴性；表明槐定堿可濃度依賴性的抑制HeLa細胞增殖、遷移和侵襲。

有研究報道miR-5195-3p通過直接靶向骨肉瘤中的NEDD9抑制細胞增殖并誘導凋亡[14]。miR-5195-3p的上調抑制了非小細胞肺癌細胞的增殖，遷移和侵襲[15]。miR-5195-3p通過直接靶向癌基因KLF5抑制人膀胱癌細胞的增殖和侵襲[16]。本實驗結果顯示，過表達miR-5195-3p后，HeLa細胞增殖抑制率、E-cadherin蛋白表達升高，劃痕愈合率、N-cadherin蛋白表達降低，細胞克隆形成數和侵襲細胞數減少；表明miR-5195-3p對HeLa細胞生物學行為具有抑制作用。槐定堿還可提高miR-5195-3p表達水平；而干擾miR-5195-3p表達逆轉了槐定堿對HeLa細胞增殖、遷移和侵襲的作用。

綜上所述，槐定堿可能通過上調miR-5195-3p表達來抑制宮頸癌HeLa細胞增殖、遷移和侵襲。