兩種不同培養(yǎng)基制備方法對振蕩法抗菌性測試結(jié)果的影響

朱曉輝，鄧智成，張?jiān)婄鳎?強(qiáng)，余圓圓，周 曼

（江南大學(xué)紡織科學(xué)與工程學(xué)院生態(tài)紡織教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫 214122）

隨著科技的進(jìn)步，人們生活水平不斷提高，對于服裝的功能性要求越來越高［1］。尤其是近兩年來全球新型冠狀病毒肆虐，在經(jīng)歷了口罩、防護(hù)服等紡織品的短缺后，人們對抗菌抗病毒紡織品有了更大的需求。因此，抗菌紡織品的檢測方法與標(biāo)準(zhǔn)也相應(yīng)地得到了重視。目前，常用的定量抗菌測試方法有吸收法和振蕩法［2］；其中，振蕩法因?yàn)閷υ嚇拥男螤詈臀砸蟛桓撸?］，所以得到了更為普遍的應(yīng)用。

目前，我國制定的紡織品振蕩法抗菌測試方法及標(biāo)準(zhǔn)有：GB/T 20944.3—2008《紡織品 抗菌性能的評價(jià) 第3 部分：振蕩法》、FZ/T 73023—2006《抗菌針織品》附錄D.8。兩種標(biāo)準(zhǔn)所描述的測試方法基本相同。在最后的制板方法中，兩種標(biāo)準(zhǔn)均采用倒板法，即振蕩接觸結(jié)束后，在稀釋至合適倍數(shù)的菌液中澆筑液態(tài)瓊脂，混合均勻制板。然而在實(shí)際的文獻(xiàn)閱讀中，我們發(fā)現(xiàn)更多的研究人員在制板時(shí)使用劃板法［4-5］，即將菌液均勻地涂布在凝固的瓊脂平板上。因此，本研究采用振蕩法測試不同織物、不同菌種以及具有不同抑菌率試樣的抗菌性，并比較了兩種不同瓊脂培養(yǎng)基制備方法對抑菌率結(jié)果的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與菌種

胰蛋白胨、牛肉浸膏、瓊脂粉（生化試劑），十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氫氧化鈉（分析純），均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗菌整理劑M（市售），大腸桿菌ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC 6538（南京樂診生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器

SW-CJ-2D 型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），TS-2102C 立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司），LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），SHJ-A4 恒溫磁力攪拌水浴鍋（常州高德儀器制造有限公司），R-3型自動定形烘干機(jī)（廈門瑞比精密機(jī)械有限公司），ME403 電子天平（梅特勒-托利多國際有限公司），一次性培養(yǎng)皿以及實(shí)驗(yàn)室常用玻璃儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基和緩沖溶液的配制

營養(yǎng)肉湯：牛肉浸膏3 g，胰蛋白胨5 g，去離子水1 000 mL，用0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至6.8±0.2，滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g，瓊脂粉15 g，去離子水1 000 mL，加熱煮沸，用0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2，滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

磷酸鹽（PBS）緩沖溶液：十二水合磷酸氫二鈉7.736 g，二水合磷酸二氫鈉1.31 g，去離子水1 000 mL，pH為7.2±0.2，滅菌后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗菌試樣的準(zhǔn)備

本實(shí)驗(yàn)采用浸漬整理法制備抗菌試樣。分別稱取抗菌整理劑M 10.5、1.5 g，加入去離子水配成1 000 mL 的整理液；將棉、滌綸織物放入整理液，在40 ℃的恒溫水浴鍋中浸漬1 h；脫去部分整理液使帶液率約為80%，60 ℃烘干，再于160 ℃焙烘2 min，即得到不同質(zhì)量濃度抗菌整理劑M 整理的棉、滌綸織物。以標(biāo)準(zhǔn)棉布為對照樣，分別稱取對照樣與抗菌織物（0.75±0.05）g，剪成5 mm×5 mm 的碎片，用錫紙包好，滅菌備用。

1.3.3 細(xì)菌接種菌懸液的制備

采用平板劃線法，將3～10 代細(xì)菌接種在營養(yǎng)瓊脂平板上，在37 ℃下培養(yǎng)18～24 h。培養(yǎng)完成后，用接種環(huán)取一個(gè)典型菌落，接種在20 mL 營養(yǎng)肉湯中，放置于振蕩培養(yǎng)箱中，37 ℃、130 r/min 培養(yǎng)18～24 h，即得到細(xì)菌接種菌懸液。

1.3.4 細(xì)菌接種菌液的準(zhǔn)備

取3 個(gè)離心管，在其中2 個(gè)中加入9 mL 營養(yǎng)肉湯，另外1 個(gè)中加入9 mL PBS 緩沖溶液。從細(xì)菌接種菌懸液中吸取2 mL 添加到第1 個(gè)9 mL 營養(yǎng)肉湯中，充分混勻后取1 mL 添加到第2 個(gè)9 mL 營養(yǎng)肉湯中，充分混勻后再取1 mL 添加到9 mL PBS 緩沖溶液中。從上述溶液中吸取5 mL，移入裝有45 mL PBS 緩沖溶液的錐形瓶中，得到細(xì)菌接種菌液。

1.3.5 “0”接觸時(shí)間制樣及抗菌試樣振蕩接觸［6］

將滅菌后的抗菌試樣和對照樣分別放入錐形瓶中，加入70 mL PBS 緩沖溶液。從細(xì)菌接種菌液中每次吸取5 mL，分別加入每個(gè)錐形瓶中。對照樣立即用力振蕩1 min，從對照樣中吸取1 mL，用10 倍稀釋法稀釋2次，混勻后，吸取1 mL移入培養(yǎng)皿中，傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15 mL制板，制作2個(gè)平行樣。室溫凝固后，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，于37 ℃下培養(yǎng)24 h。將其他裝有抗菌試樣和對照樣的錐形瓶放置在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，在24 ℃、150 r/min振蕩接觸18～24 h。

1.3.6 兩種不同的制板方法

倒板法：將振蕩接觸后的抗菌試樣以10 倍稀釋法稀釋至合適的倍數(shù)，從所需倍數(shù)的離心管中吸取1 mL，移入培養(yǎng)皿中，傾注滅菌后液態(tài)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15 mL，每個(gè)倍數(shù)制作2個(gè)平行樣。室溫凝固后倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。

劃板法：在抗菌試樣振蕩接觸的過程中，提前將滅菌后的液態(tài)瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿倒入15～20 mL，室溫靜置凝固，適當(dāng)用小風(fēng)吹，使凝固后的瓊脂平板干濕度適中；待振蕩接觸結(jié)束后，用10 倍稀釋法將各個(gè)抗菌試樣稀釋至合適的倍數(shù)，從所需倍數(shù)的離心管中吸取1 mL，移至瓊脂板上，用涂布棒均勻地涂布在平板上，每個(gè)倍數(shù)制作2 個(gè)平行樣，放置于恒溫培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。

1.4 測試

1.4.1 實(shí)驗(yàn)有效性判定

根據(jù)式（1）計(jì)算實(shí)驗(yàn)菌種的細(xì)菌增長值F。當(dāng)F大于等于1.5 時(shí)，實(shí)驗(yàn)判定為有效；否則實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)無效，需重新進(jìn)行［7］。

式中，Wt為經(jīng)過振蕩接觸后對照樣制板所得菌落數(shù)的平均值；W0為對照樣“0”接觸時(shí)間制樣所得菌落數(shù)的平均值。

1.4.2 抑菌率的計(jì)算

根據(jù)式（2）計(jì)算抗菌試樣的抑菌率Y。

式中，Wt為經(jīng)過振蕩接觸后對照樣制板所得菌落數(shù)的平均值；X為經(jīng)過振蕩接觸后抗菌試樣制板所得菌落數(shù)的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌落外觀

以1.5 g/L 抗菌整理劑M 整理織物對大腸桿菌的抗菌結(jié)果為例，兩種不同培養(yǎng)基制備方法所得到的細(xì)菌菌落生長情況如圖1 所示。由圖1 可以明顯看出兩種不同制板方法結(jié)果的差異，通過倒板法所制備的瓊脂平板經(jīng)過24～48 h 的培養(yǎng)后，其表面生長的菌落數(shù)量較多，但是形狀較小，形態(tài)呈現(xiàn)為點(diǎn)狀；而通過劃板法所制備的瓊脂平板則得到相反的情況，其表面生長的菌落數(shù)量較少，但是形狀較大，形態(tài)呈現(xiàn)為圓形。結(jié)果表明，使用倒板法制板的菌液較為分散，菌落生長得比較均勻；而使用劃板法制板的菌液在涂布時(shí)不如倒板法均勻，生長的菌落容易聚集。

圖1 抗菌整理劑整理織物對大腸桿菌的抗菌性能

2.2 抑菌率

使用不同質(zhì)量濃度的抗菌整理劑整理棉、滌綸織物，在兩種不同培養(yǎng)基制備方法下得到的抑菌率如圖2所示。

圖2 抗菌試樣的抑菌率

實(shí)驗(yàn)所得細(xì)菌增長值均大于等于1.5，可以判定 實(shí)驗(yàn)有效。抑菌率偏差如表1所示。

表1 兩種制板方法的抑菌率偏差

由圖2、表1可以看出，在使用振蕩法對抗菌試樣進(jìn)行抗菌性能測試的實(shí)驗(yàn)過程中，最后制作瓊脂平板時(shí)使用倒板法或劃板法所得到的抑菌率相差不大，劃板法所得到的抑菌率結(jié)果比倒板法略高一些。兩種不同的制板方法對大腸桿菌的抑菌率影響相對較大，抑菌率偏差接近5%；對金黃色葡萄球菌的抑菌率影響則相對較小，抑菌率偏差不超過3%。特別是在抗菌效果優(yōu)異（抑菌率達(dá)到99.99%）時(shí)，抑菌率沒有差別。因此，這兩種制板方法都是可行的，實(shí)際操作時(shí)可根據(jù)自身需要選用。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選用最具有代表性的革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）為實(shí)驗(yàn)菌種，對最常見的滌綸和棉織物采用振蕩法測試抗菌性能。結(jié)果表明，在抗菌測試的過程中，劃板法和倒板法兩種制板方法都是可行的，得到的抑菌率偏差不超過5%。使用劃板法制作的瓊脂板，其生長的細(xì)菌菌落數(shù)量較少，并且菌落長得較大，便于觀察和計(jì)數(shù)，但制板時(shí)在瓊脂板表面涂布菌液的過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。使用倒板法制作瓊脂板操作簡便，但是其生長的菌落較小，并且數(shù)量多，不便于計(jì)數(shù)。另外，制板時(shí)必須注意液態(tài)瓊脂的溫度，溫度過高會殺死菌液中的細(xì)菌，溫度過低瓊脂會凝固結(jié)塊，無法與菌液均勻混合，兩者都會使實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較大誤差甚至失敗。綜上所述，在進(jìn)行抗菌測試時(shí)，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)環(huán)境和條件選擇合適的培養(yǎng)基制備方法。