一種對甲螨無形態損傷的DNA提取技術

陳燕南，范 成，張 鋒，朱朝東，陳 軍*

(1. 中國科學院動物研究所動物進化與系統學院重點實驗室，北京 100101；2. 河北大學生命科學學院動物系統學與應用重點實驗室，河北保定 071002；3. 中國科學院大學，北京 100049)

甲螨(oribatid mites)隸屬于節肢動物門Arthropoda蛛形綱Arachnida蜱螨亞綱Acari疥螨目Sarcoptiformes甲螨亞目Oribatida，其體型微小(體長多為0.1～1 mm)，形態結構復雜，種類眾多，目前世界上已經發現并記錄的甲螨達11 000種以上，估計實際種數超過50萬種(Norton and Behan-Pelletier, 2009)。甲螨多棲息于土壤腐殖質中，主要為菌食性和腐食性，在土壤腐殖質的分解過程中發揮著重要作用，是一類重要的土壤動物。

由于甲螨種類眾多、個體微小，某些種類形態結構還存在種內變異現象，因而僅僅依靠其形態特征有時難以準確鑒定物種和分析其系統發育關系(Navajas and Fenton, 2000)。20世紀分子生物學的革命性變化，尤其是在80年代中期聚合酶鏈式反應技術和DNA測序技術的產生，促進了分子生物學在物種鑒定與進化研究方面的應用(Cruickshank, 2010)。進入21世紀以來，分子分類技術(Tautzetal., 2003)和DNA條形碼技術(Hebertetal., 2003a)等新研究手段更是極大地推動了分子分類學在生物多樣性研究中的廣泛應用。在進行上述相關研究時，往往首先需要提取生物的DNA。但是，由于體型微小，體壁高度硬化，從甲螨個體提取DNA而又不損傷其外部形態結構特征非常困難，從而使得分子分類學在甲螨多樣性研究中尚未得到很好應用。

在其它螨類研究中，往往可以從同一物種中挑選出多個個體，將這些個體徹底粉碎研磨然后進行DNA提取，便可獲得足夠的DNA。但這種方法應用在甲螨研究中面臨著極大的障礙：甲螨物種眾多，從一號土樣中分離出的甲螨一般不止一種；形態特征多樣且不易觀察；大多數種類體表高度骨化，依據形態特征進行物種鑒定時，必須對標本進行透明(一般為浸泡在乳酸中一周至一個月時間)后在顯微鏡下觀察。經過這些步驟處理后的標本便很難再從中提取DNA。為保證分子數據與形態鑒定所對應標本的一致性，需要首先提取甲螨的DNA，并盡可能保留其形態結構特征，然后再進行傳統的形態學物種鑒定(Rowleyetal., 2007)。

為解決這些問題，近年來有不少學者曾嘗試探討過保存憑證標本的無損傷DNA提取技術。高艷等研究并改進了小型節肢動物無形態損傷的DNA提取方法(高艷和卜云, 2014)；單振菊等也曾研究過一種具厚幾丁質外殼微小節肢動物無損傷DNA提取方法(單振菊等, 2017)。但這些方法在甲螨中的應用效果并不是很理想。國外學者Ota等(2011)、Ahaniazad等(2018)雖然針對甲螨無損傷DNA提取方法進行過探討，并取得了一定的進步，但Ota等的方法只在某些甲螨類群(卷甲螨科Phthiracaridae、洼甲螨科Camisiidae和長單翼甲螨科Protoribatidae)中可以提取出足夠的DNA，不能在所有的甲螨DNA提取中取得良好的效果。Ahaniazad等提供的方法需要自己配制試劑，這與應用商品化的DNA提取試劑盒相比將會更加耗時，特別是當樣本量非常多時，顯然會耗費大量的時間，而且自己配制試劑進行DNA提取也不容易保證DNA質量的穩定性。因此，非常有必要在無形態損傷DNA提取方面繼續改良技術。

本研究在前人研究的基礎上，結合了試劑盒DNA提取法，提出一套針對甲螨無形態損傷的高效DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1甲螨的獲得

在北京市奧林匹克森林公園(N40°0′46.29″, E116°22′50.30″)柏樹林下采集土壤樣本，將土樣放在布氏漏斗(Berlese-Tullgren funnel)中，自然風干120 h，并在布氏漏斗底部放一個盛有30 mL無水乙醇的200 mL燒杯用來收集甲螨標本，在收集過程中及時補充無水乙醇。

將收集到的甲螨標本在體視顯微鏡下查看，挑選數頭形態特征相同的個體，通過清洗、透明、制作臨時玻片后在系統顯微鏡下觀察形態特征，經鑒定后均為大翼甲螨科Galumnidae大翼甲螨屬Galumna顯大翼甲螨中華亞種Galumnaobviussinensis(Jacot, 1922)。然后在其它土樣分離得到的甲螨中挑選該種標本，用于后續研究。

1.1.2試劑

QIAGEN組織和血液DNA提取試劑盒。

1.2 方法

1.2.1DNA的提取

向6個滅菌的1.5 mL離心管中各放入1頭甲螨樣本，再向6個離心管中各加入180 μL Buffer ATL，之后再分別加20 μL蛋白酶K，混勻后，55℃水浴24 h，次日取出離心管，分別向每個離心管中加入200 μL Buffer AL，然后70℃水浴10 min。再從水浴鍋里取出離心管，向離心管里加入200 μL無水乙醇。將離心管內的液體充分混勻之后，將離心管內所有的液體全部轉移到吸附柱內，并將離心管內存留的甲螨標本用蒸餾水沖洗干凈后放入80%乙醇中保存。將吸附柱放進離心機中8 000 rpm離心1 min，換上新的收集管，向吸附柱內加入500 μL的Buffer AW1，再將吸附柱放進離心機中8 000 rpm離心1 min，再換上新的收集管，向吸附柱內加入500 μL Buffer AW2，此時將吸附柱放進離心機中14 000 rpm離心4 min。最后換上滅過菌的離心管，向吸附柱內加入50μL Buffer AE，將離心管靜止1 h后，再將其放進離心機中8 000 rpm離心2 min。在-20℃保存DNA模板。

1.2.2PCR擴增反應

PCR反應體系：正反引物各1 μL，PCR Master Mix 15 μL，ddH2O 3 μL，DNA模板5 μL。擴增引物如下：正向引物Lco1490：5′-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′；反向引物Hco2198: 5′-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3′；引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR擴增的反應條件如下：96℃預變性3 min，95℃變性10 s，46℃退火30 s，72℃延伸1 min，運行35個循環。最后72℃延伸5 min。

1.2.3PCR反應產物檢測

每個樣本取5 μL PCR產物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，結果用凝膠電泳成像系統觀察。

1.2.4測序及比對

將電泳分析有目的條帶的PCR產物原液送北京天一輝遠生物科技有限公司進行常規純化雙向測序。為驗證所提取的DNA確實是來自于甲螨的DNA，將測序所得結果與GenBank數據庫進行比對，以確定PCR擴增序列以及DNA模板是否正確。

1.2.5臨時玻片標本的制作

將提取完DNA之后保留下來的甲螨標本放在凹形載玻片上，滴上少許乳酸，稍微調整甲螨肢體的姿勢使其便于觀察；輕輕蓋上蓋玻片，用吸水紙在載玻片上吸收多余的乳酸；稍等片刻，在顯微鏡下觀察并拍照。拍照后將甲螨標本放入80%乙醇保存。

1.2.6掃描電鏡拍照

將提取完DNA之后保留下來的甲螨標本放在脫水硅膠中脫水24 h，脫水后的甲螨噴金后放入掃描電鏡下拍照，以觀察其形態特征是否完好。

2 結果與分析

2.1 DNA序列分析

將測序所得的結果與GenBank數據庫進行比對，比對結果顯示本次實驗提取的DNA序列與甲螨亞目中的大翼甲螨科Galumnidae同源性最高，驗證了所提取的DNA是來自大翼甲螨科。但由于GenBank數據庫中缺少顯大翼甲螨中華亞種Galumnaobviussinensis(Jacot, 1922)的DNA序列數據，所以造成與本次實驗提取的DNA序列的最高相似度也只有86%左右，并不能達到精確的物種水平的鑒定。

2.2 甲螨標本的形態對比

將未進行DNA提取實驗的甲螨標本與經過本次DNA提取實驗的甲螨標本分別制作成臨時玻片在顯微鏡下進行形態觀察，并進行掃描電鏡拍照。對比結果顯示：提取過DNA的甲螨標本形態保存完好，并沒有發生明顯的形態改變(圖1)。其重要的分類學特征如：感器(bothridial setae)、梁毛(lamellar setae)、吻毛(rostral setae)、前背板(prodorsum)、后背板(notogaster)、翅形體(pteromorph)、下顎體(subcapitulum)、生殖板(genital plate)、肛板(annal plate)、步足(leg)等均保存完好(圖1, 圖2)，可以作為憑證標本長期保存。

圖1 提取DNA的甲螨標本與未提取DNA的甲螨標本掃描電鏡對比照片Fig.1 SEM photographs of oribatid mites with DNA extraction and without DNA extraction注：A，B，背面觀；C，D，腹面觀；A，C為未提取過DNA的甲螨標本；B，D為提取DNA的甲螨標本。Note: A, B, Dorsal view; C, D, Ventral view; A, C, Specimen without DNA extraction; B, D, Specimen after being DNA extracted.

圖2 經過DNA提取之后的甲螨標本形態結構掃描電鏡照片Fig.2 SEM photographs of morphological characters after being DNA extracted in oribatid mites注：ad，肛側毛；ag，側殖毛；an，肛毛；AP，肛板；bs，感器；GP，生殖板；in，梁間毛；L，步足；le，梁毛；PTM，翅形體；ro，吻毛。Note: ad, Adanal setae; ag, Aggenital; an, Anal setae; AP, Annal plate; bs, Bothridial setae; GP, Genital plate; in, Interlamellar setae; L, Leg; le, Lamellar setae; PTM, Pteromorph; ro, Rostral setae.

3 結論與討論

本實驗所選取的顯大翼甲螨中華亞種個體相對較大(體長725～775 μm，寬525～550 μm)，使用此無損DNA提取方法，可以只用一頭標本就能提取出足夠的DNA。對于其它體型更小的甲螨，可以適當增加甲螨的個數，以保證能夠提取出足夠的DNA用于后續的分子生物學實驗。

隨著DNA條形碼和分子分類學等新概念的提出，利用基因序列輔助鑒定物種已經越來越普遍，許多分類學者都在積極地參與構建包含不同物種形態特征與分子數據的數據庫(Hebertetal., 2003b)。當前，雖然在各大數據庫中已收錄了一些甲螨物種的DNA序列數據，但是很多的DNA序列都沒有憑證標本與之對應，這可能是由于很多情況下在進行DNA提取實驗時已經將甲螨標本破壞了，只有一些在DNA提取之前借助顯微鏡拍攝的照片可供查閱、參考和比較。然而甲螨由于種類眾多、形態特征多樣、體型微小等因素影響，僅僅根據這些照片一般很難對這些標本的物種鑒定是否正確進行核對，與之對應的分子數據的可靠性無疑會大打折扣，這在一定程度上也限制了甲螨分子生物學的相關研究。

目前對于甲螨的分子分類學工作者們而言，一個較大的難點就是如何將DNA分子數據與甲螨的形態特征數據準確無誤地對應起來。在其它體型較大的動物中，通常采取的做法是取標本個體的一小部分來進行DNA提取，其余的部分作為憑證標本進行保存(Starks and Peters, 2002)。甲螨個體微小，很難只取一小部分進行DNA提取就能獲得后續實驗所需足夠的DNA，況且甲螨一般具有較堅硬的外殼，在進行切取的時候很難保證不損傷重要的形態特征，實際操作中很容易造成整個個體都被破壞，從而導致后續無法依據形態特征進行物種鑒定。而使用本研究提供的甲螨DNA提取方法，既能獲得足夠的DNA，還可以相當完好的保存憑證標本，有助于開展甲螨分子生物學研究。

致謝：感謝蒙皓博士在分子生物學實驗中給予的指導，感謝張魁艷老師、李榮同學在掃描電鏡觀察與拍照過程中給予的幫助。