氣相色譜串聯質譜分析引起蜜蜂中毒的農藥及其代謝物

周萍 李珊珊 尹志紅 吳曉群 李櫻紅 胡福良

（1 杭州碧于天保健品有限公司，桐廬 311500；2 浙江大學動物科學學院，杭州 310058；3 桐廬縣市場監管局，桐廬 311500；4 浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310052）

蜜蜂作為一種自然界和農業生態系統中龐大的、高效的傳粉昆蟲[1]，其授粉產生的社會和經濟效益遠大于蜂產品自身[2]。蜜蜂的健康不僅可以保證蜂農獲得良好的經濟效益、保證蜂產品安全，而且還有益于維護生態系統的平衡。

蜜蜂在自然界活動的過程中存在中毒的現象。一方面，養蜂是蜂農的主要經濟收入來源，為了最大限度保證蜜蜂能夠正常生產蜂產品，需要使用藥物來防治蜂病。然而，蜂農的違規用藥，導致蜂產品中出現禁用藥物或者超過限量要求的藥物殘留，導致蜂產品中藥物殘留超標，甚至可能導致蜜蜂的中毒死亡。另一方面，為了農作物、果蔬、森林、植被等植物的病蟲害防治，人們需要噴灑農藥。農藥在蜜源植物上的使用已經非常普遍[3]，這也會不同程度地導致蜜蜂中毒[4-6]，同時也會引起蜂產品中的藥物殘留超標。此外，有毒蜜源、有毒花粉[7]等也可以引起蜜蜂中毒。

氣相色譜串聯質譜儀可以對大多數高溫下易揮發且不易分解的化學物質進行全掃描分析，這些化學物質經離子化后得到的碎片離子在儀器上得到檢測，通過質譜數據庫定性分析出藥物的分子量、化學結構式和化學名稱，使用該化學物質的標準品可以進一步進行定量分析。這對于鑒定某樣品中存在某種具體化學物質非常有效[8-10]。將氣相色譜串聯質譜儀用于中毒蜜蜂中農藥殘留成分的鑒定分析目前尚鮮見報道。

本文就一起蜜蜂中毒事件，用氣相色譜串聯質譜儀分析了中毒蜜蜂和2 種可疑藥物（用于蜜蜂的藥品），通過與健康蜜蜂的色譜圖比較，分析出存在的具體藥物及其含量，對這些藥物的合規性、毒性進行分析，得出造成蜜蜂中毒的可能原因。通過此次蜜蜂中毒事件，我們提出了一些科學安全的養蜂用藥對策，以指導蜂農進行合理用藥。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Angilent 7890B-7000D 氣相色譜儀串聯質譜儀；Sartorius BS224S 分析天平；旋轉蒸發儀；研缽；超聲波儀；臺式離心機；標準品：雙甲脒、單甲脒（DMPF）、2,4-二甲基苯胺（DMA）、2,4-二甲基苯基甲酰胺（DMF）、蠅毒磷、克螨特、氟胺氰菊酯（純度≥98%，Sigma 公司）；乙腈為HPLC 級。

中毒蜜蜂、健康蜜蜂、可疑蜂藥1、可疑蜂藥2，由江蘇東臺清華蜂業公司提供。

1.2 分析方法

1.2.1 樣品處理

1.2.1.1 藥物處理：稱取2 g 樣品，加入20 mL 乙腈，超聲提取20 min，4500 rpm 離心3 min，取上清液0.2 mL，用乙腈定容至10 mL。

1.2.1.2 蜜蜂處理：取約20 g 蜜蜂，用研缽研成漿狀，稱取2 g，加入20 mL 乙腈，超聲提取20 min，4500 rpm 離心3 min，取上清液10 mL，40℃下旋轉蒸發至干，用乙腈定容至1 mL。

1.2.2 測試條件

1.2.2.1 氣相色譜質譜儀器條件

色譜柱：HP-5MS，30 m×0.25 mm×0.25 μm

升溫程序：50℃（1 min）→10℃/min →140℃→25℃/min →180℃→12℃/min → 300℃（5min）

流速：1.0 mL/min

進樣量：1 μL

進樣口溫度：250℃

不分流進樣

質譜條件：離子源溫度280℃，色譜質譜接口溫度280℃，溶劑延遲：4 min，燈絲電流400 μA，電子倍增器eV=70,增益因子20，計算EMV=1568.1 V。

1.2.2.2 定性分析：全掃描M/Z=50-500。

1.2.2.3 定量分析的離子對監測方法：DMRM 監測。

DMRM 監測藥物離子對及碰撞電壓見表1，粗體為定量離子對。

表1 DMRM監測藥物離子對及碰撞電壓

1.2.3 標準曲線制備

分別稱取雙甲脒、單甲脒（DMPF）、2,4-二甲基苯胺（DMA）、2,4-二甲基苯基甲酰胺（DMF）、蠅毒磷、克螨特、氟胺氰菊酯標準品各10 mg，分別用乙腈配制成1000 mg/L 的貯備液。分別吸取適量貯備液混合，用乙腈配制適當濃度的混合標準中間液，用該中間液以乙腈為溶劑，通過逐級稀釋的方法，最終稀釋成5 μg/L，10 μg/L，20 μg/L，50 μg/L，100 μg/L 系列標準溶液。按1.2.2.1 和1.2.2.3 的條件進行上機檢測。以各種藥物標準液的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 定性與定量

將1.2.1 處理的樣液按1.2.2 的條件進行上機分析。運用安捷倫質譜數據軟件NIST-2014年版，進行各色譜峰定性分析，用外標法進行藥物的定量分析。

2 結果與分析

2.1 樣品處理與凈化

蜂藥中含有較高濃度的藥物，當稀釋足夠倍數時，基質效應會大大降低。實驗表明，當稀釋500倍時，藥物的樣液呈無色透明，上機檢測可以獲得滿意的全掃描色譜圖。

蜜蜂主要成分為蛋白質、纖維素類，不溶于乙腈，乙腈對色素的溶解度非常低，采用本文的方法處理后，樣液呈淡黃色，上機檢測可以獲得滿意的全掃描色譜圖。

2.2 樣品全掃描結果分析

樣品上機進行全掃描分析，出現若干色譜峰，見圖1。運用安捷倫質譜數據軟件NIST-2014年版，進行各色譜峰分析，發現了如下物質：

萘：出峰時間11.3 min，具有香樟氣味，驅蟲劑。

DMF：出峰時間12.4 min，殺蟲劑雙甲脒的代謝物。

對叔丁基苯酚：出峰時間15.8 min，具有特殊的苯酚氣味，制造醫藥驅蟲劑、農藥克螨特的原料。

克螨特：出峰時間19.2 min

以上4 種物質，除DMF 外均在藥物和中毒蜜蜂和可疑藥物1 中找到。DMF 在中毒蜜蜂中存在，在可疑藥物1 中未找到。考慮蜂農可能還使用了另一種藥物，經過詢問，蜂農講述還使用了另一種藥物（可疑藥物2）。我們按1.2 分析方法進行了檢測，色譜圖見圖2，結果未掃描到高濃度的DMF 在內的藥物。

分析表明，可疑藥物1 中添加了萘和克螨特成分，而且在該藥物中檢出了制造克螨特的原料成分——對叔丁基苯酚，說明所添加的克螨特可能為工業級。

2.3 樣品定量分析結果討論

將1.2.1 處理的樣品，按1.2.2 條件進行DMRM定量分析檢測，色譜圖見圖2。

排除了病毒源性、有毒蜜源、粉源的因素，蜜蜂中毒至死很可能攝入了大量的藥物。我們采用靈敏度更高的GC/MS/MS方法，對2 種藥物、健康蜜蜂和中毒蜜蜂進行了蜂產品中高風險藥物克螨特、雙甲脒及其代謝物、蠅毒磷和氟胺氰菊酯[11]的定量分析，分析結果如表2：

從表中可知，我們從中毒蜜蜂中檢出超高含量的克螨特、雙甲脒代謝物和蠅毒磷，從可疑藥物1 中檢出相同種類的藥物，其中克螨特含量高達9250 mg/kg，表2中的所有成分在可疑藥物2 中均未檢測出，可以推定：中毒蜜蜂攝入了大量可疑藥物1。

表2 蜜蜂和可疑藥物中高風險藥物含量

農藥對蜜蜂的毒性有較多文獻報道[12-17]，以上藥物在中毒蜜蜂中的殘留量雖然很高，但是從可以查到的資料看，都未達到各種藥物的半數致死量（LD50）。蜜蜂的死亡很可能是多種高濃度藥物長期綜合作用的結果[18]。

值得注意的是：閱讀可疑藥物1 標簽內容，發現配方中僅為升華硫，并沒有克螨特、雙甲脒代謝物和蠅毒磷成分，然而卻在檢測中發現這些成分的大量存在。所以，該藥物的質量值得高度懷疑。

3 討論

本文建立了用乙腈溶解稀釋樣品，經超聲提取，運用氣相色譜串聯質譜儀進行分析，用全掃描方法鑒定可疑物質，用DMRM 方法對藥物定量，分析中毒蜜蜂、健康蜜蜂和可疑藥物中的農藥種類和含量，為科學分析蜜蜂中毒原因提供一定的參考。

近年來，隨著歐盟等進口國對蜂產品提出日益嚴苛的藥物殘留要求，越來越多的藥物種類從蜂產品中檢出，蜂產品的質量安全問題越來越受到蜂產品生產者、管理者和消費者的關注。利用科學手段對蜜蜂飼養、蜂產品安全進行控制已經迫在眉睫。為此，我們提出如下建議供同行參考：

（1）廣大蜂農要掌握科學用藥知識，提高科學養蜂水平。正確認識“預防為主”，通過飼養抗病力強的蜂種、飼養強群、加強營養、保溫、通風、降濕等管理手段來減少病害的發生，不能有病沒病都用藥防治。一旦病害發生，到非用藥治療不可時，必須做到絕不使用國家頒布的禁用獸藥及其他化合物。

（2）要特別關注蜂藥的質量與安全性，蜂農使用藥物前，應仔細確認是否含有禁用藥物或者毒性較高的藥物。而且，蜂藥必須從正規渠道采購，有了質量問題可以投訴，減少蜂農損失。

（3）蜂藥使用的劑量必須根據蜂群的實際需要，杜絕超劑量頻繁濫用藥物。蜂農為了確保蜂群健康，出于多重保險考慮，往往會同時使用多種藥物，這反而增加蜂群的健康危害，甚至導致蜂群的中毒死亡[18]。

（4）國家相關管理部門應加大對蜂藥的管理力度，對不按批文規定生產蜂藥，特別是添加違禁藥物的蜂藥廠家依法嚴厲查處。本例中，可疑藥物1 獲得合法的生產批文，卻在實際生產中添加了大量法律禁止使用的藥物，其真實配方與標簽配方嚴重不符，屬于嚴重的違法行為。