意大利蜜蜂雄蜂不同組織中BH4及其相關生物胺含量差異分析

舒蕊 劉健 趙萍 劉震 代君君

（安徽省農業科學院蠶桑研究所，合肥 230061）

生物胺是進化上保守的神經化學物質，作為一種弱堿性低分子量含氮化合物，主要由氨基酸脫羧形成或醛類、酮類氨基化形成，在無脊椎動物和脊椎動物中作為神經遞質、神經激素和神經調節劑發揮作用[1]。昆蟲體內生物活性胺主要有5 種，即多巴胺（dopamine,DA）、酪胺（tyramine，TA）、章魚胺（octopamine，OA）、色胺（serotonin,5-HT）和組胺（histamine）[2]。昆蟲生物胺調節廣泛行為的神經回路，包括種內攻擊性[3]、嗅覺敏感性和氣味辨別力[4]、晝夜節律[5]、記憶形成[6]以及表現群居物種的行為狀態轉變[7]。其中，攝食與生殖是生物胺影響的較為重要的兩個生理行為。

一是生物胺影響蜜蜂的攝食行為：在社會性群居昆蟲中，勞動者的生物胺水平會隨環境而變化，并與行為發育和分工有關。例如，OA對蜜蜂的攝食活動有很強的影響，工蜂大腦中OA 水平隨著日齡增長以及在巢外獲得的經驗而增高[8]。OA的實驗性升高導致幼蜂提前離開蜂巢開始覓食[9]，也改變采集蜂的資源選擇[10]，并且通過舞蹈語言影響采集蜂對各類攝食場地的“獲利”[11]。蜜蜂OA和TA參與了攝食行為中的食物“喚醒”過程：喙伸展反射是蜜蜂覓食行為中的一種引起食欲的刺激，它是通過用一滴糖水觸碰一根觸角而引起的。用藥物利血平耗盡蜜蜂神經系統中的單胺類物質，30%的蜜蜂喙伸展反射消失，其余蜜蜂對該反射的反應性降低。注射OA或其代謝前體TA 可恢復無反應動物的反射，TA 也可增強有反應性動物的反射[12]。可見，TA 和 OA有促進蜜蜂攝食的作用。然而，蜜蜂大腦中5-HT 的增加會抑制進食，刺激腸道的肌肉收縮；但蜜蜂血淋巴中5-HT 的普遍升高并不影響食物的攝取[13]。

二是生物胺影響蜜蜂生殖發育及生殖行為：社會性生活的昆蟲具有嚴格的生殖任務分擔，大都只需要極少數個體承擔生殖任務，有的甚至一個群體中只有一個個體承擔生殖任務。一個蜂群中只有蜂王承擔生殖任務。生物胺是影響昆蟲生殖狀態非常重要的一種微量物質。研究發現正常蜜蜂群中蜂王腦內的DA含量要比工蜂腦內的含量高；如果蜂群中缺少蜂王，一些工蜂腦中的DA含量明顯升高，接著其卵巢管開始發育并能產卵，以致成為真正的生殖工蜂，說明蜜蜂腦內的DA含量變化能改變其生殖狀態[14]。在黃蜂（Bombus terrestris）[15]和[16-17]、螞蟻（Diacamma）和果蠅（Drosophila melanogaster）中，發現多巴胺和卵巢發育的關系也是如此[18-19]。在沒有蜂王的蜂群中，工蜂卵巢中5-HT受體（Am5-HT7）表達上升[20]，另外，在沒有蜂王的黃蜂群中，5-HT含量高的個體，卵巢更發達[16]。研究者給無蜂王的蜂群中的工蜂喂食OA或TA，發現喂食TA的蜜蜂卵巢發育增強，并產生更多的蜂王信息素，促進了工蜂向蜂王轉變；并且喂食OA的工蜂產生工蜂信息素的能力增強，鞏固了工蜂原有的生殖狀態[21]。

總的來說，五種生物胺中，TA、DA 和5-HT 有促進昆蟲卵巢發育的作用；OA 有抑制昆蟲卵巢發育的作用；組胺對昆蟲生殖狀態影響的效果和方向目前尚不明晰。可見，不同生物胺對昆蟲生殖狀態影響方向不同。

三是昆蟲BH4及其相關生物胺合成途徑：DA、DA和5-HT的生物合成途徑如圖1所示：DA由酪氨酸（tyrosine）代謝而來，酪氨酸在酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase,TH）羥基化作用下形成多巴（dopa），然后多巴通過多巴脫羧酶（dopa decarboxylase,DDC）形成多巴胺，其中酪氨酸的羥化反應步驟是多巴胺合成的限速步驟[22]。TA也是以酪氨酸為底物，通過酪氨酸脫羧酶（tyrosine decarboxylase,TDC）脫羧形成的[23]。OA是在酪胺的基礎上，經過酪氨酸-?-羥化酶（tyrosine hydroxylase,TBH）羥基化形成的[24]。5-HT由色氨酸（tryptophan）衍生而來，第一步是限速步驟，是色氨酸在色氨酸羥化酶（tryptophan hydroxylase,TPH）作用下生成5-羥色氨酸（5-hydroxy tryptophan,5-HTP），其產物再通過5-羥色氨酸脫羧酶(aromatic L-amino acid decarboxylase,AADC）作用生成5-HT[25]。

DA、DA 和5-HT 的合成限速步驟都需要四氫生物蝶呤（Tetrahydrobiopterin,BH4）作為輔因子。BH4 是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸三種芳香族氨基酸羥化酶的輔因子[26]。BH4 缺乏會使酪氨酸羥化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）和色氨酸羥化酶（Tryptophan hydroxylase，TPH）活性降低，導致神經遞質前質多巴（DOPA）和5-羥色氨酸（5-HTP）生成受阻，影響了腦內神經遞質DA、5-HT 的生成，所以BH4是生物胺合成的限速因子[27]。如圖1所示，BH4 在轉化為醌類二氫生物蝶呤（Quinone dihydrobiopterin,qBH2）過程中，為這三種生物胺的合成提供了幫助。

綜上所述，生物胺在蜜蜂的攝食和生殖行為中發揮著重要的作用，相關的研究報道較多的停留在這幾種神經遞質本身，并且研究對象集中于雌性蜜蜂，而對于影響生物胺生物合成的代謝通路鮮有關注，特別是BH4 作為形成DA、TA、5-HT 這三種生物胺必不可少的營養輔因子，蜜蜂中未見有關BH4 及其與生物胺相互作用的研究報道。

本研究選擇意大利蜜蜂中的雄蜂作為研究對象，測定雄蜂四個組織中影響攝食和生殖的三種生物胺（DA、TA、5-HT）含量以及影響三者合成的BH4 含量，初步分析蜜蜂群中的雄性個體體內BH4 及其相關生物胺的水平差異，為后續更好地研究蜜蜂體內BH4與生物胺的相互作用及其功能提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗蜜蜂

選擇安徽省農業科學院蠶桑研究所意蜂實驗蜂場的五個蜂箱內的雄蜂共20 只，冷凍于-80 ℃冰箱內，以備后用。

1.2 蜜蜂組織處理

利用解剖刀或解剖剪將20 只雄蜂的頭(去除觸角)、胸、腹、足四部分組織分離，每一種組織用液氮和研缽，研磨成粉后，稱取1 g，加入9 g 的pH 7.2～7.4 的PBS 緩沖液，用勻漿器將標本勻漿充分，靜置10 分鐘。隨后在4 ℃、2000 rpm/min 條件下離心20 分鐘，收集上清。每一個樣品的測定樣都如上所述處理，每一個樣品設置3 個平行樣。其余上清液冷凍備用，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心，去除沉淀后再使用。

1.3 測定步驟

1.3.1 測定試劑盒

昆蟲四氫生物蝶呤(BH4)酶聯免疫分析試劑盒、昆蟲5-羥色胺(5-HT)酶聯免疫分析試劑盒、昆蟲多巴胺（DA）酶聯免疫分析試劑盒、昆蟲章魚胺(OA)酶聯免疫分析試劑盒，均購自于上海莼試生物技術有限公司。

1.3.2 操作步驟

1.3.2.1 標準品的稀釋：按照表1在試管中進行稀釋，獲得相應的標準品溶液。

表1 標準品稀釋表

1.3.2.2 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5 倍）。加樣時將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

1.3.2.3 溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 分鐘。

1.3.2.4 配液：將30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 倍稀釋后備用。

1.3.2.5 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

1.3.2.6 加酶：每孔加入酶標試劑50 μL，空白孔除外。

1.3.2.7 溫育：操作同1.3.2.3。

1.3.2.8 洗滌：操作同1.3.2.5。

1.3.2.9 顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 分鐘。

1.3.2.10 終止：每孔加終止液50 μL，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

1.3.2.11 測定：以空白孔調零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。測定應在加終止液后15 分鐘以內進行。

1.3.3 計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD 值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。待測物質的標準曲線依次為：BH4，y=66.72x-0.3572（R2=0.9958）；DA，y=32.431x + 0.3441（R2=0.9955）；OA，y=45.937x-0.049（R2=0.9945）；5-HT，y=50.0790x-0.6702（R2=0.9948）。

1.3.4 數據處理

根據標準曲線，計算出所測物質的含量后，運用SPSS軟件進行平均值、標準差及數據間的相關性分析，再利用GraphPad Prim 8 軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 意大利蜜蜂雄蜂BH4及三種生物胺的含量分析

依次測定意大利蜜蜂雄蜂的頭部（Drone bee-Head，DL）、胸部（Drone bee-Thorax，DT）、腹部（Drone bee-Abdomen，DA）和足（Drone bee-Leg，DL）四種組織中BH4、DA、OA、5-HT 含量，共得到48 個數據，共計16 組數據。通過SPSS 軟件先進行均值與標準差分析，得到數據表2；再對每一組數據進行顯著性相關性分析，利用畫圖軟件GraphPad Prim 8 作圖得到圖2。

表2 BH4及生物胺含量的平均值及標準差

由表2和圖2可知，BH4、DA、OA、5-HT 在意大利蜜蜂雄蜂體內的四個組織中分布水平各有不同。BH4、DA、5-HT 三者在四種組織的含量分布趨勢基本一致，都是頭 ＞ 胸 ＞ 腹 ＞ 足，且大部分組間數據具有顯著性差異（p＜0.05）。OA 在四種組織中的含量雖略有不同，但是不具有顯著性差異（p＜0.05）。同時，四種物質都是在雄蜂的頭部含量最高。

2.2 意大利蜜蜂雄蜂BH4及三種生物胺含量相關性分析

利用SPSS 軟件里的相關性分析，對意大利蜜蜂雄蜂四種組織中所測得的BH4、DA、OA、5-HT 含量計算相關系數，相關系數矩陣如表3。

如表3所示，BH4與DA、5-HT顯著相關（p＜0.01），與OA沒有相關性（p＞0.01）。同理可知，DA、BH4、5-HT三者之間顯著相關（p＜0.01），但是三者與OA 都沒有相關性（p＞0.01）。這一結果與四種物質在雄蜂不同組織間的分布趨勢吻合。

表3 相關系數矩陣

3 討論

蜂群中的雄性個體的主要作用是繁衍族群，作為父本與蜂王交配，產生子代，延續蜂群。雄蜂的生殖功能就是對于蜂群最大的意義，相對地，雄蜂自身的生存技能，比如采粉尋蜜等功能被大大地削弱甚至消失。雄蜂一般都是依靠蜂群中的工蜂才能獲得食物，直接被喂食或者采食蜂巢中的蜂蜜。生物胺作為能夠同時影響生殖與攝食的神經遞質、神經激素和神經調節劑，其在雄蜂中的分布與功能是值得關注的。

本研究選擇影響蜜蜂生殖和攝食行為的最重要的三種生物胺——DA、OA 和5-HT，以及影響三者合成的輔因子——BH4，測定了這四種物質在意大利蜜蜂雄蜂四種組織間的分布水平。結果發現，雄蜂的頭部（大腦）中四種物質的含量最高，這與它們的組織分布和功能是一致的，調控生殖與攝食行為的主要器官就是蜜蜂的大腦。此外，雄蜂的胸部、腹部、足中BH4、DA、OA 的分布水平依次下降，而5-HT 的含量與頭部基本一致，組織間并無顯著性差別。SPSS相關性分析也發現，BH4、DA、OA 三者間呈顯著相關（p＜0.01），5-HT 與三者都沒有相關性（p＞0.01）。由此我們發現，雖然從生理上的合成代謝通路上來看，DA、OA、5-HT 都需要BH4 作為輔因子，但是在意蜂雄蜂體內BH4 對于DA、OA 合成的影響遠遠大于5-HT，這可能與三者的生理功能差異有關。

DA、OA 和5-HT 在蜜蜂中發揮的功能各有差異。在生殖方面，DA 和5-HT 都有促進蜜蜂卵巢發育的作用，OA 則有抑制蜜蜂卵巢發育的作用；在攝食方面，TA 和OA 有促進蜜蜂攝食的作用，5-HT 是有抑制蜜蜂攝食的作用。可見，三者的功能是多樣且復雜的，同時當前關于蜜蜂生物胺的研究較多的集中于雌性蜂上，對于雄蜂的生殖和攝食影響相關的研究較少，暫時也無法準確的判斷雄蜂體內DA、OA 和5-HT 分布的具體意義，但是我們的研究明確地表明了意大利蜜蜂雄蜂體內同樣存在這三種影響雄蜂生理功能的生物胺，并且蜜蜂體內的DA、OA 的合成直接受到BH4的影響，且三者的分布趨勢呈現明顯的相關性。