強心方對慢性心力衰竭大鼠心肌線粒體能量代謝與自噬的影響

羅遠林， 徐燕梅， 譚志強， 周學鋒， 劉煥云

（1.樂山市人民醫院，四川樂山 614000；2.樂山職業技術學院醫學系，四川樂山 614000；3.重慶兩江新區第一人民醫院心血管內科，重慶 401121）

慢性心力衰竭（chronic heart failure）（簡稱慢性心衰）是心臟多種疾病發展至終末期的臨床綜合征，其發病機理與心肌長期缺血導致的心臟結構改變有關[1-2]。慢性心衰治療多以藥物為主，其中，中醫藥發揮日益重要的作用。中醫古代文獻無慢性心衰病名記載，根據癥狀可將其歸屬于“心痹”“心悸”“喘證”“水腫”等范疇，其主要病機以心陽氣虛為本，瘀血、水飲、痰濁為標，屬本虛標實之證[3]。對于慢性心衰患者，在西藥規范化治療基礎上加用溫陽活血利水方藥（強心顆粒）能夠減輕慢性心衰患者的臨床癥狀，可增強心肌收縮力，增加心輸出量，明顯改善心功能等[4]。已有實驗研究證實，采用溫陽活血利水法對慢性心衰大鼠具有良好的治療作用，并有助于改善慢性心衰大鼠的預后[5]。本研究采用的強心方是參考強心顆粒組方進行加減的經驗方，具有活血、補氣及利水功效。本研究通過構建慢性心衰大鼠，觀察強心方的治療機制，以期為其臨床應用治療慢性心衰提供依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物72只SPF級Wistar雄性大鼠，體質量200 ～250 g，由基爾頓生物科技（上海）有限公司提供，動物質量許可證號：SYXK（上）2019-0006，在通風且干凈的環境中對大鼠進行飼養，5只大鼠1個籠子，溫度為23 ℃左右，濕度要求為50%左右，黑夜白晝交替循環，自由進食標準顆粒飼料，飲干凈飲用水。所有實驗動物于開始實驗前，適應環境飼養1周。動物實驗的實施嚴格遵照《實驗動物護理和使用指南》，動物實驗地點為重慶大學動物實驗中心。

1.2 試劑與儀器單磷酸腺苷（AMP）、二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（天津金克隆生物技術有效公司）；考馬斯亮藍染色試劑盒（上海紀寧生物科技有限公司）；過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）-γ 抗體（武漢益普生物科技有限公司）；微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ（LC3-Ⅱ）抗體（美國Abcam 公司）； p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）抗體[微蒙（上海）生物科技有限公司]；GAPDH 抗體（云南圣克魯斯生物科技有限公司）；異硫氰酸熒光素（FITC）標記熒光二抗（武漢博士德生物工程有限公司）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒[康迪斯化工（湖北）有限公司]；免疫熒光染色試劑盒-抗兔FITC（上海碧云天生物技術有限公司）。L535R低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；S80彩色多普勒超聲診斷儀[大為醫療（江蘇）有限公司]；UG-1 熒光顯微鏡[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Leica TCS SP8激光掃描共聚焦顯微鏡（成都生物所公共實驗技術中心提供）。

1.3 藥物及制備強心方的組成為黃芪9 g、炒白術9 g、干姜6 g、水蛭6 g、茯苓12 g、車前子9 g、枳實9 g、葶藶子6 g、炙甘草12 g。將上述所有中藥材加10 倍量水煎煮60 min，過濾，藥渣再加8 倍量水煎煮60 min，過濾，減壓濃縮至相對密度1.25 ～1.30 的稠膏，加適量糊精混合均勻，制成顆粒，60 ℃烘干，整粒，分裝。規格為每袋9 g，每袋相當于原生藥材17.31 g，由我院藥劑科制備并提供?？ㄍ衅绽◤V州邁特興華制藥公司產品，批號：國藥準字H44023128）。

1.4 造模建模前對72只大鼠均采用S80彩色多普勒超聲診斷儀進行心臟檢查，以確保心功能正常。抽取60只大鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉后，連接小動物呼吸機，在3 ～4 肋骨間分離皮膚后剪開心包后用5 號絲線結扎左側心耳及動脈圓錐正下方2 mm處，后縫合皮膚。待大鼠自主呼吸后撤掉呼吸機。連續3 d 注射40 萬U 的青霉素。剩余12只大鼠僅切口穿線不結扎。4周后，行心臟彩超，若左心室射血分數（LVEF）＜45%，則判斷為建模成功[6]。因感染導致死亡大鼠5只，共有55只大鼠建模成功。僅切口穿線不結扎的大鼠無死亡。

1.5 分組與干預方法將55只造模成功的大鼠按照體質量隨機分為模型組，卡托普利組，強心方低、中、高劑量組，每組11只。將其余12只僅切口穿線不結扎的大鼠設為假手術組。大鼠給藥劑量按成人與大鼠體表面積法[7]進行換算，為7.92 g·kg-1·d-1（設為中劑量），高、低劑量分別為中劑量的2 倍和1/2 倍，即15.84、3.96 g·kg-1·d-1。建模第1天，強心方低、中、高劑量組大鼠分別灌胃3.96、7.92、15.84（生藥）g·kg-1·d-1的強心方混懸液，卡托普利組大鼠灌胃10 g/mL 的卡托普利。假手術組和模型組分別灌胃等體積生理鹽水溶液。每日1次，連續4周。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 ELISA法檢測血清AMP、ADP、ATP含量干預4周后，麻醉大鼠，胸部主動脈采血，3500r/min（離心半徑10 cm）離心10 min，取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書操作，應用酶標儀在400 nm波長處檢測光密度（OD）值，根據標準曲線和OD值計算血清ATP、ADP、AMP水平。

1.6.2 考馬斯亮藍染色法檢測心肌組織Na+-K+ATP酶及Ca2+-Mg2+ATP酶的活性 干預4周后，麻醉大鼠，取左側心室心肌組織100 mg，制備組織勻漿，將低速離心機調整為3500 r/min（離心半徑10 cm），運轉10 min 后，保留上清液。按照考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒說明書，經蛋白濃度測定，酶促反應，定磷及ATPase 活力計算等步驟檢測心肌組織Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶活性的變化。

1.6.3 HE染色法觀察心肌組織形態 心臟組織甲醛固定后，進行石蠟包埋，切片5 μm。脫蠟，蘇木素染色10 min 后以小流量自來水沖洗，1%的鹽酸乙醇褪色變紅后停止操作，再次1%伊紅復染，脫水。封片。最后光學顯微鏡下觀察心肌組織形態。

1.6.4 免疫熒光法檢測心肌組織自噬蛋白LC3-Ⅱ表達 取心室肌組織部分PBS 清洗，4%多聚甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，烤片。在切片組織上滴加正常山羊血清，室溫封閉60 min。吸水紙吸掉封閉液，再在每張切片組織上滴加足夠量的LC3-Ⅱ抗體（1∶200）并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。陰性對照用PBS 液代替一抗。取出濕盒，室溫復溫30 min，PBS浸洗切片3次，每次3 min。吸水紙吸干切片組織上多余液體后滴加稀釋好的FITC 熒光二抗（1∶800），濕盒中37 ℃孵育60 min。PBS 清洗3 次，每次3 min。滴加DAPI 避光孵育15 min。PBS 清洗4 次，每次5 min。用含有抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。在高倍鏡（×200）下，每張組織切片選取3個視野，每一個視野計數100個細胞，按LC3-Ⅱ陽性細胞所占百分比進行評分，無陽性表達計0 分，陽性細胞數＜30%計1 分，陽性細胞數≥30%計2分。

1.6.5 蛋白免疫印跡法檢測心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白表達 取心肌組織，裂解提取蛋白，BCA 法進行蛋白定量；加入5×十二烷基硫酸鈉（SDS）上樣緩沖液，煮沸使蛋白變性；加樣，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白后，電轉移至PVDF 膜；用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗稀釋液p38MAPK（1∶500）、p-p38MAPK（1∶500）、PPAR-γ（1∶500），內參為GAPDH（1∶2000），室溫孵1 h后5 ℃孵育過夜；加入HRP 標記的IgG 稀釋液（1∶5000），室溫孵育1 h；加入電化學發光試劑（ECL）顯影，凝膠成像系統進行圖像采集和分析，結果以目的蛋白條帶與GAPDH 蛋白條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.7 統計方法采用SPSS 23.00 統計軟件進行數據分析，實驗數據結果以均數± 標準差（x±s）表示，多組比較采用單因素方差異分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清中ATP、ADP、AMP含量比較表1結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠血清ATP 含量降低，ADP、AMP 含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，強心方低、中、高劑量組與卡托普利組大鼠血清ATP 含量升高，ADP、AMP 含量降低（P＜0.05），其中，強心方低、中、高劑量組上述指標組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05），強心方高劑量組上述指標與卡托普利組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠血清中三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、單磷酸腺苷（AMP）含量比較Table 1 Comparison of ATP，ADP and AMP levels in serum among various groups of rats （±s，μg·mL-1）

表1 各組大鼠血清中三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、單磷酸腺苷（AMP）含量比較Table 1 Comparison of ATP，ADP and AMP levels in serum among various groups of rats （±s，μg·mL-1）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與強心方低劑量組比較；④P＜0.05，與強心方中劑量組比較

組別假手術組模型組強心方低劑量組強心方中劑量組強心方高劑量組卡托普利組F值P值鼠數/只121111111111 ATP 755.80±130.55428.47±127.45①552.15±100.20①②586.90±124.50①②③620.44±130.10①②③④609.44±122.56①②③④9.590＜0.001 ADP 3004.20±305.473845.25±415.22①3655.10±390.22①②3480.19±333.11①②③3105.70±284.06①②③④3147.02±251.04①②③④11.530＜0.001 AMP 1050.80±224.301628.39±442.17①1381.22±354.47①②1256.39±331.07①②③1168.10±256.68①②③④1201.55±228.00①②③④4.6140.001

2.2 各組大鼠心肌組織線粒體酶活性比較表2結果顯示：與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織勻漿中Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，強心方低、中、高劑量組與卡托普利組Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶活性升高（P＜0.05），其中，強心方低、中、高劑量組上述指標組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05），強心方高劑量組上述指標與卡托普利組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠心肌組織線粒體酶活性比較Table 2 Comparison of mitochondrial enzyme activities in myocardial tissues among various groups of rats（±s，μmol·mg-1·h-1）

表2 各組大鼠心肌組織線粒體酶活性比較Table 2 Comparison of mitochondrial enzyme activities in myocardial tissues among various groups of rats（±s，μmol·mg-1·h-1）

①P＜0.05，與假手術組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與強心方低劑量組比較；④P＜0.05，與強心方中劑量組比較

組別假手術組模型組強心方低劑量組強心方中劑量組強心方高劑量組卡托普利組F值P值鼠數/只121111111111 Na+-K+ATP酶7.80±0.604.25±0.31①5.50±0.47①②5.89±0.33①②③6.69±0.51①②③④6.80±0.66①②③④68.7900.001 Ca2+-Mg2+ATP酶7.41±0.404.20±0.29①5.30±0.30①②6.08±0.41①②③7.10±0.26①②③④7.04±0.30①②③④157.600＜0.001

2.3 各組大鼠心肌組織病理形態比較圖1結果顯示：假手術組大鼠心肌組織形態規則，細胞核分布均勻，未見變性壞死；模型組大鼠心肌組織細胞變形，結構紊亂，部分纖維組織斷裂，伴大量炎癥細胞浸潤；強心方低、中、高劑量組及卡托普利組大鼠心肌纖維排列逐漸規則，心肌細胞水腫及壞死減少，逐漸恢復正常，炎癥細胞浸潤減少，其中以強心方高劑量組改善最顯著，改善程度與假手術組相近。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態比較（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the histopathological morphology of myocardium among various groups of rats（HE staining，×200）

2.4 各組大鼠心肌組織自噬蛋白LC3-Ⅱ表達比較圖2、圖3結果顯示：假手術組大鼠心肌組織自噬蛋白LC3-Ⅱ陽性表達率為（10.15±0.33）%、模型組為（49.66±7.55）%，強心方低、中、高劑量組分別為（30.49±4.11）%、（26.28±3.52）%、（22.30±2.80）%，卡托普利組為（23.06 ± 3.11）%。多組間比較存在差異（F=112.800，P＜0.05）。進一步兩兩比較：模型組LC3-Ⅱ陽性表達率高于假手術組（P＜0.05）；與模型組比較，強心方低、中、高劑量組與卡托普利組中LC3-Ⅱ陽性表達率均降低（P＜0.05），其中，強心方低、中、高劑量組LC3-Ⅱ陽性表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），強心方高劑量組LC3-Ⅱ陽性表達率與卡托普利組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠心肌組織自噬蛋白LC3-Ⅱ陽性表達率比較Figure 2 Comparison of the positive expression rate of autophagy protein LC3-Ⅱin myocardial tissues among various groups of rats

圖3 各組大鼠心肌組織自噬蛋白LC3-Ⅱ陽性表達情況比較（免疫熒光法，×200）Figure 3 Comparison of myocardial tissue positive expression of autophagy protein LC3-Ⅱamong various groups of rats（immunofluorescence method，×200）

2.5 各組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ 蛋白表達比較表3、圖4結果顯示：與假手術組比較， 模型組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK 蛋白表達水平升高，PPAR-γ 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，強心方低、中、高劑量組與卡托普利組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK 蛋白表達水平降低，PPAR-γ 蛋白表達水平升高（P＜0.05），其中，強心方低、中、高劑量組上述指標組間比較，差異有統計學意義（P＜0.05），強心方高劑量組上述指標與卡托普利組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白電泳條帶圖Figure 4 Electrophoretic strip images of p38MAPK，p-p38MAPK and PPAR-γ proteins in myocardial tissues in various groups of rats

表3 各組大鼠心肌組織中p38MAPK、p-p38MAPK、PPAR-γ蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of protein expression levels of p38MAPK，p-p38MAPK and PPAR-γ in myocardialtissues among various groups of rats

3 討論

多種原因誘發的心衰均與心肌細胞線粒體自噬及能量異常代謝有關[8]。線粒體與中醫學“氣”的功能相似。心衰發生發展過程中伴隨心肌線粒體損傷，多認為與心氣虛有關[9]。氣為血之帥，心氣虛致血液、水液運行不暢，導致血瘀、水停心下，引發短氣不足以息、水腫、心悸等一系列癥狀。另外，疾病發生發展的根本原因是人體機能的太過與不及，自噬參與多種疾病的病理過程，如心血管疾病的發生發展。自噬相當于機體正氣與邪氣調控，中醫認為，邪氣侵襲人體而致病，必然是正氣虛弱，所謂“邪之所湊，其氣必虛”。當自噬相關基因低表達時，則可導致心血管疾病的發生[10]。改善心肌細胞自噬及線粒體能量代謝能力異常，可緩解心衰。

線粒體形態功能損傷是慢性心衰心功能降低及心肌細胞凋亡的主要因素之一。線粒體通透性改變進而上調大分子物質穿過內膜導致線粒體腫脹及膜電位改變，進一步影響心肌細胞能量代謝。心衰時心肌組織代謝異常，ATP 酶活力降低（主要包括Na+-K+ATP 酶及Ca2+-Mg2+ATP 酶活力的降低），導致心肌細胞內鈉離子水平升高、細胞內外鈣鎂離子分布失衡而造成鈣超載[11-12]。心肌細胞內鈣超載會上調磷脂酶活性，誘導線粒體損傷，引起細胞自噬，加重心衰病理損傷[13]。有研究[14]表明，心肌組織Na+-K+ATP酶及Ca2+-Mg2+ATP酶降低提示細胞心肌細胞能量代謝障礙，因此，通過改善心肌細胞線粒體能量代謝狀態能夠控制疾病發展。本研究結果顯示，強心方各劑量組與卡托普利組血清ATP 含量和心肌組織Na+-K+ATP 酶活性、Ca2+-Mg2+ATP 酶活性高于模型組，血清ADP、AMP含量低于模型組（P＜0.05），其中，高劑量組與卡托普利組差異無統計學意義（P＞0.05），表明強心方能夠增強慢性心衰大鼠心肌線粒體能量代謝而發揮心臟保護作用。

有研究[15]表明，心衰大鼠模型自噬蛋白LC3-Ⅱ表達上調，7 d 后大鼠心肌細胞自噬功能被激活，提示心肌細胞自噬參與了心衰病理損傷過程。還有研究[16]證實，對心衰大鼠采用姜油酮有效治療后心肌自噬蛋白LC3-Ⅱ表達降低，亦表明降低心肌自噬蛋白LC3-Ⅱ表達可減少心肌損傷。本研究結果顯示，強心方各劑量組LC3-Ⅱ陽性表達率低于模型組（P＜0.05），與卡托普利組比較無顯著性差異（P＞0.05），表明強心方可通過減少心肌細胞線粒體自噬而發揮心肌細胞保護作用。

p38MAPK 是MAPK 的下游因子，廣泛分布于人體細胞中，在缺氧及炎性反應時表達升高[17]。心衰時心肌p-p38MAPK 可將細胞外信息傳遞至細胞核，通過轉錄因子調節多種靶基因共同加重心肌線粒體結構改變及代謝異常等[18]。PPAR-γ 是PPAR 的家族成員之一，具有多種生物調節功能，如抑制炎癥及抗腫瘤等[19]。PPAR-γ 在心肌代謝異常疾病中呈低表達，是改善心臟病變的重要靶標。有研究表明，通過激活心衰大鼠PPAR-γ表達后能夠增強心肌細胞能量代謝，從而改善心臟重構[20]。本研究結果顯示，強心方各劑量組心肌組織p38MAPK、p-p38MAPK 蛋白表達水平低于模型組，PPAR-γ蛋白表達水平高于模型組（P＜0.05），與卡托普利組比較無顯著性差異（P＞0.05），表明強心方可通過抑制心衰大鼠心肌組織中p38MAPK活化、促進PPAR-γ表達發揮心肌保護作用。

綜上所述，強心方能夠通過提高慢性心衰大鼠心肌線粒體能量代謝，降低心肌細胞自噬，抑制心肌p38MAPK 活化、促進PPAR-γ 蛋白表達，進而減輕病變。