王飛 辛雅萱 董章宏 趙文植 李衛(wèi)英 馬路遙 夏茂甜 辛培堯

摘要：【目的】分析無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組特征及密碼子偏好性，為無(wú)刺龍舌蘭葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)、修飾和物種進(jìn)化研究提供參考。【方法】對(duì)無(wú)刺龍舌蘭的葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝和注釋，分析密碼子偏好性及其影響因素，并通過(guò)建立高、低基因表達(dá)庫(kù)，篩選出最優(yōu)密碼子。基于20個(gè)已發(fā)表的龍舌蘭科植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。【結(jié)果】無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組總長(zhǎng)157579 bp，大單拷貝區(qū)（LSC）、小單拷貝區(qū)（SSC）和2個(gè)反向重復(fù)區(qū)（IRa和IRb）的長(zhǎng)度分別為85940、18279和26680 bp，GC含量為37.8%，包括135個(gè)基因（85個(gè)蛋白編碼基因、38個(gè)tRNA基因、8個(gè)rRNA基因及4個(gè)未知功能的基因），從中篩選出51個(gè)長(zhǎng)度大于300 bp的基因編碼區(qū)（CDS）序列，其有效密碼子數(shù)（ENC）均大于41.0。GC1、GC2、GC3和GC3s含量分別為46.75%、39.61%、29.19%和26.06%，說(shuō)明密碼子第3位多以A/T結(jié)尾。GCall與GC1、GC2和GC3均呈極顯著相關(guān)（P<0.01，下同），但GC3與GC1和GC2均無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05，下同），表明密碼子第1、2位的堿基組成相似，但與第3位的相似度不高。選擇和突變是導(dǎo)致葉綠體基因組密碼子偏好性的主要因素。篩選出14個(gè)多以A/U結(jié)尾的最優(yōu)密碼子。無(wú)刺龍舌蘭與克雷塔羅絲蘭和西地格絲蘭為姊妹關(guān)系，自薦值為100%。【結(jié)論】無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組為保守的四分體結(jié)構(gòu)，葉綠體基因組密碼子偏好性較弱，主要受選擇和突變等多因素影響。基于植物葉綠體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)在物種的分類鑒定及確定各物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究中是一種準(zhǔn)確、可靠的方法。

關(guān)鍵詞：無(wú)刺龍舌蘭;葉綠體基因組;密碼子偏好性;系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào)：S563.8? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）04-1030-10

Chloroplast genome characteristics and codon preference analysis of Yucca treculeana

WANG Fei， XIN Ya-xuan， DONG Zhang-hong， ZHAO Wen-zhi，

LI Wei-ying， MA Lu-yao， XIA Mao-tian， XIN Pei-yao

（Southwest Landscape Architecture Engineering Technology Research Center of National Forestry and Grassland Administration， Southwest Forestry University/Key Laboratory of Biodiversity Conservation in Southwest China of National Forestry and Grassland Administration， Southwest Forestry University， Kunming， Yunnan? 650224， China）

Abstract：【Objective】To analyze chloroplast genome characteristics and codon preference of Yucca treculeana， so as to provide reference for the study of chloroplast-related gene expression，modification and species evolution. 【Method】Chloroplast genome of Y. treculeana was sequenced， assembled and annotated to analyze codon preference and its influe-ncing factors， and the optimal codon was screened by establishing high and low gene expression libraries. Phylogenetic tree was constructed based on 20 published chloroplast genome data of Agavaceae plants. 【Result】The total length of Y. treculeana chloroplast genome was 157579 bp， and the length of the large single copy region（LSC）， small single copy region（SSC）， and two reverse repeat regions（IR），namely IRa and IRb regions were 85940， 18279 and 26680 bp， respectively. The total GC content was 37.8%. Among 135 genes （85 protein-coding gene， 38 tRNA， 8 rRNA and 4 unknown functional genes）， 51 coding DNA sequences（CDS） with length greater than 300 bp were screened out， and the ENC was greater than 41.0. The contents of GC1， GC2， GC3 and GC3s were 46.75%， 39.61%， 29.19% and 26.06%， respectively， indicating that the third codon most ended in A/T. GCall was significantly correlated with GC1， GC2 and GC3 （P<0.01， the same below）， but GC3 was not significantly correlated with GC1 and GC2 （P>0.05， the same below）， suggesting that the base composition of the first and second codon of chloroplast genome was basically similar，but the similarity with the third codon was not high. Selection and mutation were the main causes of chloroplast genome codon preference. 14 optimal codons ending in A/U were screened out. Y. treculeana was sisterly with Y. queretaroensis and Y. schidigera，and the bootstrap values was 100%. 【Conclusion】The chloroplast genome of Y. treculeana has a conserved tetrad structure， and the codon bias is weak， which is mainly affected by multiple factors such as selection and mutation. It is an accurate and reliable method to construct phylogenetic tree based on chloroplast genome in studying the taxonomic identification and phylogenetic relationship among plant species.

Key words： Yucca treculeana; chloroplast genome; codon preference; phylogeny analysis

Foundation items：Yunnan Science and Technology Department Science and Technology Plan Development Key Research Project （2018BB005）; Southwest Forestry University Science and Technology Innovation Fund Project （KY21034）

0 引言

【研究意義】無(wú)刺龍舌蘭（Yucca treculeana）為絲蘭屬（Yucca）多年生植物，原產(chǎn)于北美洲，多生于降雨稀少的沙漠地區(qū)，適應(yīng)性強(qiáng)，劍形葉，花莖高挺，整體形態(tài)優(yōu)美，具有極高的觀賞價(jià)值，且其根和莖分別用作啤酒發(fā)泡劑、除臭劑的生產(chǎn)原料，葉纖維強(qiáng)韌亦可用于制作繩纜（Irish，2000）。據(jù)調(diào)查，絲蘭屬內(nèi)約有40個(gè)種。截至2021年7月，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已確定發(fā)表葉綠體全基因組的絲蘭屬植物有6種。目前，絲蘭屬植物在不同分類系統(tǒng)存在爭(zhēng)議，根據(jù)哈欽松系統(tǒng)和克朗奎斯特系統(tǒng)將其劃分為龍舌蘭科（Agavaceae）;而APG Ⅲ分類系統(tǒng)則將其定位至天門冬科（Asparagaceae）（http：//www.iplant.cn/info/Yucca）。造成分類差異的原因不僅與分類系統(tǒng)本身有關(guān)，還與絲蘭屬植物形態(tài)特征相似度較高密切相關(guān)。因此，在利用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法分類存在爭(zhēng)議的情況下，借助無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)能直觀反映物種間遺傳關(guān)系，同時(shí)有助于對(duì)其進(jìn)行分類（Kai et al.，2018）。此外，通過(guò)分析無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組密碼子偏性，可優(yōu)化基因密碼子，提高目的基因表達(dá)水平，對(duì)選育優(yōu)良品種具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】葉綠體是綠色植物和部分藻類用于光合作用的細(xì)胞器（Jia-Yee et al.，2015），也是除線粒體外的另一個(gè)含有遺傳信息的細(xì)胞器。與含有龐大遺傳信息的核基因組相比，葉綠體基因組長(zhǎng)度較小，僅為160 kb左右，且堿基含量和基因數(shù)量均較少，但因葉綠體內(nèi)基因所在位置的特殊性，其具有結(jié)構(gòu)完整性和序列保守性（Parks et al.，2009;Jansen and Uhlman，2012）。葉綠體基因組為單親遺傳，堿基很少發(fā)生替換，使其在植物分類及系統(tǒng)進(jìn)化研究中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)（Tao et al.，2017）。在解析植物葉綠體基因組特征的基礎(chǔ)上，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析探究物種間進(jìn)化關(guān)系已有相關(guān)報(bào)道。高亞芳等（2019）通過(guò)對(duì)藥用植物金鐵鎖葉綠體基因組的測(cè)序、組裝和注釋，明確了其基因組成，進(jìn)而利用葉綠體全基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，解析了石竹科屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。段義忠和張凱（2021）對(duì)2種沙冬青屬植物葉綠體基因組的反向重復(fù)區(qū)（IR）進(jìn)行比對(duì)分析，并基于葉綠體基因組構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，為該屬的物種鑒別、種群動(dòng)態(tài)研究打下基礎(chǔ)。此外，作為編碼氨基酸的遺傳密碼子在基因功能和蛋白質(zhì)表達(dá)的研究中意義重大。肽鏈合成過(guò)程中每種氨基酸對(duì)應(yīng)1～6種密碼子（即同義密碼子）（牛元等，2018），但密碼子的使用偏好于一種或幾種特定密碼子，稱為密碼子偏好性（Li et al.，2019）。只有無(wú)選擇壓或基因突變的情況下，才不存在密碼子使用偏好性（Long et al.，2018）。但實(shí)際上，生物體是自然選擇的結(jié)果，均存在密碼子使用偏好性（Li et al.，2019）。密碼子使用偏好性存在于各生物體中，自然選擇、堿基組成、基因的長(zhǎng)度和表達(dá)水平、RNA豐度和二級(jí)結(jié)構(gòu)、氨基酸保守性等均可能造成密碼子使用偏好性（Xu et al.，2011）。目前，不同植物密碼子偏好性分析已有相關(guān)報(bào)道。金剛等（2018）揭示了同為龍舌蘭科植物劍麻的葉綠體基因組密碼子偏好性，并指出密碼子使用偏好性受選擇和突變等多重因素影響。另外，香花枇杷（屈亞亞等，2021）、杧果（辛雅萱等，2021）、永椿香槐（李江飛等，2021）和蒜頭（原曉龍等，2021）等葉綠體基因組密碼子偏好性分析均是在測(cè)序獲得葉綠體全基因組的基礎(chǔ)上，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其密碼子使用模式及形成原因。【本研究切入點(diǎn)】無(wú)刺龍舌在植物分類中仍存在一定的爭(zhēng)議，利用其葉綠體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)有助于其分類研究，但目前未見(jiàn)絲蘭屬植物葉綠體基因組特征及密碼子偏好性的相關(guān)研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)無(wú)刺龍舌蘭的葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝和注釋，分析密碼子偏好性及其影響因素，并通過(guò)建立高、低基因表達(dá)庫(kù)，篩選出最優(yōu)密碼子;基于20個(gè)已發(fā)表的龍舌蘭科植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，為無(wú)刺龍舌蘭乃至絲蘭屬植物葉綠體相關(guān)基因的表達(dá)、修飾和物種進(jìn)化研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為新鮮無(wú)刺龍舌蘭葉片，采自于中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，將采集好的樣葉裝入自封袋放入液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后保存于-80 ℃的超低溫冰箱備用。主要設(shè)備儀器：超微量紫外分光光度計(jì)（DN2000）、核酸蛋白測(cè)定儀（NanoDrop 2000 Thermo Scientific）、瓊脂糖凝膠電泳儀（北京六一DYCP-31DN）和凝膠成像系統(tǒng)（Gene Company Limited，GBOX.E3）。

1. 2 DNA提取及測(cè)序

采用改良CTAB法提取無(wú)刺龍舌蘭的全基因組DNA（Windarti et al.，2021），并利用瓊脂糖凝膠電泳及NanoDrop2000對(duì)其完整性、質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)。將檢測(cè)合格的DNA樣品送至北京諾禾致源科技股份有限公司建庫(kù)測(cè)序。

1. 3 葉綠體基因組組裝、注釋及編碼區(qū)（CDS）序列挑選

以克雷塔羅絲蘭（Yucca queretaroensis）（登錄號(hào)KX931468）為參考序列，使用GetOrganelle進(jìn)行基因組序列組裝（Jin et al.，2020），采用GeSeq（https：// chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/geseq.html）對(duì)無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組進(jìn)行注釋（Tillich et al.，2017），再用Geneious 8.1.3手動(dòng)校正（Kearse et al.，2012）。將注釋好的無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組數(shù)據(jù)（登錄號(hào)OL912952）上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）。利用OGDRAW（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）（Lohse et al.，2013）繪制無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組物理圖譜。

利用Geneious 8.1.3、BioEdit Sequence Alignment Editor和ORFfinder（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/）對(duì)無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組進(jìn)行分析，共獲得85個(gè)基因的CDS序列。為了降低誤差，剔除長(zhǎng)度小于300 bp、內(nèi)部含有終止密碼子和重復(fù)基因的序列，最終篩選出51個(gè)以ATG為起始密碼子的CDS用作后續(xù)分析。

1. 4 密碼子相關(guān)參數(shù)計(jì)算

使用CodonW 1.4.2和CUSP（https：//bioinforma-tics.nl/emboss-explorer/）統(tǒng)計(jì)上述篩選出的51個(gè)CDS序列的有效密碼子數(shù)（Effective number of codon，ENC）、同義密碼子相對(duì)使用度（Relative synonymous codon usage，RSCU）、各CDS序列總GC含量（用GCall表示），以及密碼子第1、2、3位上的GC含量（分別用GC1、GC2和GC3表示）。

1. 5 中性繪圖分析

利用中性繪圖直觀反映影響密碼子使用偏好性因素，即利用Excel 2010以CDS的GC3值為橫坐標(biāo)、GC12（GC1和GC2的均值）為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，用于分析GC12和GC3的相關(guān)性，進(jìn)而判斷密碼子偏好性影響因素（Jiang et al.，2008）。若GC12與GC3相關(guān)性顯著，回歸系數(shù)接近1，說(shuō)明突變是其主要影響因素;反之，則說(shuō)明GC12與GC3差異大，自然選擇是主要影響因素（Wei et al.，2014）。

1. 6 ENC-plot分析

利用Excel 2010以GC3為橫坐標(biāo)、ENC為縱坐標(biāo)，利用兩者的實(shí)際值來(lái)構(gòu)建二維散點(diǎn)圖，并在圖中添加ENC=2+GC3+29/[GC2+（1-GC3）2]的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)散點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)曲線周圍的分散情況，再結(jié)合ENC比值頻率，進(jìn)而判斷影響密碼子偏好性的原因（Sueoka，2017）。若代表CDS的散點(diǎn)落在曲線附近，則密碼子偏好性受突變影響;而落在曲線下方較遠(yuǎn)的位置，則受自然選擇影響（Wang et al.，2018）。

1. 7 PR2-plot分析

利用Excel 2010以G3/（G3+C3）為橫坐標(biāo)、A3/（A3 +T3）為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪圖，用于分析密碼子第3位上的堿基組成。圖的中心點(diǎn)表示A=T且G=C，即無(wú)偏性的密碼子狀態(tài)，由中心點(diǎn)向其余點(diǎn)發(fā)出的矢量表示偏性方向和程度（Yang et al.，2015）。

1. 8 最優(yōu)密碼子分析

同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU）作為選擇最優(yōu)密碼子的條件之一，RSCU=1時(shí)，密碼子無(wú)偏好性;RSCU>1時(shí)，密碼子使用頻率偏高;反之，表示密碼子出現(xiàn)頻率低（Wu et al.，2019;惠小涵等，2020）。最優(yōu)密碼子選擇時(shí)，以ENC為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)51個(gè)CDS序列的ENC進(jìn)行排序，分別從ENC最高和最低兩端選取10%的基因，建立高、低表達(dá)庫(kù)。計(jì)算ΔRSCU值（ΔRSCU=RSCU高表達(dá)-RSCU低表達(dá)），將ΔRSCU≥0.08，且RSCU>1的密碼子定為最優(yōu)密碼子。

1. 9 系統(tǒng)發(fā)育分析

為了確定無(wú)刺龍舌蘭在龍舌蘭科中的系統(tǒng)發(fā)育位置，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)下載20個(gè)已發(fā)表的龍舌蘭科植物葉綠體基因組與外類群綿棗兒（Barnardia japonica），結(jié)合無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。將22個(gè)葉綠體基因組序列用MAFFT 7比對(duì)，BioEdit手動(dòng)調(diào)整，用最大似然法（ML）對(duì)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，使用RAxML 8.2.12中的HPC2 on XSEDE模型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（Stamatakis et al.，2008;Katoh and Standley，2013），最后用FigTree 1.4.0進(jìn)行樹(shù)圖美化。

2 結(jié)果與分析

2. 1 葉綠體基因組基本特征分析結(jié)果

無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組大小為157579 bp，呈反向平行的雙鏈環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，大單拷貝區(qū)（LSC）、小單拷貝區(qū)（SSC）和2個(gè)IR區(qū)（IRa和IRb）的大小分別為85940、18279和26680 bp，平均GC含量為37.8%。另外，葉綠體基因組共有135個(gè)基因（85個(gè)蛋白編碼基因、38個(gè)tRNA基因、8個(gè)rRNA基因及4個(gè)未知功能的基因），絕大多數(shù)存在于LSC 區(qū)（圖1）。4個(gè)未知功能的基因中，ycf3和ycf4位于LSC區(qū)，ycf2位于IR區(qū)并有一個(gè)拷貝，ycf1基因則位于SSC區(qū)和IRb區(qū)的交界位置。值得注意的是，LSC區(qū)的atpB基因出現(xiàn)了1個(gè)突變位點(diǎn)和1個(gè)缺失位點(diǎn)，導(dǎo)致該基因序列不能正常翻譯，基因功能喪失，致使假基因化。

2. 2 密碼子組成及使用度分析結(jié)果

無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組密碼子組成如圖2所示。GC1、GC2和GC3含量分別為46.75%、39.61%和29.19%。密碼子第1、2、3位的GC分布并不均勻，第3位上的GC含量明顯低于前兩位，分布趨勢(shì)為GC1>GC2>GC3，GC3s含量為26.06%，表明密碼子第3位多以A/T 結(jié)尾。

ENC理論取值范圍為20.0～61.0，與同義密碼子的偏性呈負(fù)相關(guān)。無(wú)刺龍舌蘭51個(gè)CDS序列的ENC為41.2～61.0，均>41.0，說(shuō)明無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組密碼子偏好性較弱。其中，ndhE基因的ENC為理論取值范圍的上限（即61.0），說(shuō)明該基因密碼子使用無(wú)偏好性。

從密碼子各參數(shù)的相關(guān)分析結(jié)果（表1）可看出，GCall與GC1、GC2和GC3均呈極顯著相關(guān)（P<0.01，下同），且GC1與GC2及ENC值與GC3均呈極顯著相關(guān)，但GC3與GC1和GC2均無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05，下同），表明葉綠體基因組密碼子第1、2位的堿基組成基本類似，但與第3位的堿基相似度不高。而葉綠體基因組密碼子數(shù)與各GC含量和ENC均無(wú)顯著相關(guān)性。

從無(wú)刺龍舌蘭各氨基酸RSCU分析（表2）可看出，RSCU>1的密碼子共30個(gè)，多為A/U結(jié)尾，而以G/C結(jié)尾的密碼子RSCU多數(shù)都小于1，表明無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組密碼子偏好以A/U結(jié)尾。

2. 3 中性繪圖分析結(jié)果

從圖3可看出，GC12和GC3的取值范圍分別為0.33～0.51和0.22～0.35，回歸系數(shù)（即斜率）為0.0391，GC12與GC3的相關(guān)系數(shù)（R）為0.024，二者相關(guān)性弱，表明密碼子第1、2位與第3位之間堿基的相關(guān)性不強(qiáng)，可初步判斷出自然選擇是影響密碼子使用偏好性的主要因素之一。

2. 4 ENC-plot分析結(jié)果

從圖4中可看出，多數(shù)基因CDS序列處于標(biāo)準(zhǔn)曲線下方。再結(jié)合圖5可知，ENC比值分布在-0.05～0.05區(qū)間的基因CDS序列有15個(gè)，其接近標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)際ENC與預(yù)期ENC接近，說(shuō)明其偏好性主要受突變影響;而其余36個(gè)基因CDS序列的ENC比值分布在 -0.05～0.05區(qū)間之外，位于標(biāo)準(zhǔn)曲線較遠(yuǎn)的位置，表示與預(yù)期ENC相差較大，即這部分基因密碼子偏好性與GC3含量有關(guān)。因此，除了突變的影響，自然選擇等其他因素很大程度上也會(huì)影響密碼子的偏好性。

2. 5 PR2-plot分析結(jié)果

PR2-plot繪圖是通過(guò)分析密碼子第3位堿基類型，從而揭示密碼子使用偏性影響因素。由圖6可知，51個(gè)基因CDS序列在圖中4個(gè)區(qū)域分布并不均勻，其中，左下方分布較多。T>A、C>G，即嘧啶使用頻率高于嘌呤，進(jìn)一步說(shuō)明突變并不是影響無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組密碼子使用偏好性的唯一因素，選擇、堿基組成等其他因素對(duì)其密碼子使用偏好性也有一定影響。

2. 6 最優(yōu)密碼子的確定

對(duì)ENC進(jìn)行排序，從兩端各選5個(gè)基因來(lái)構(gòu)建高、低表達(dá)庫(kù)，分別計(jì)算△RSCU，結(jié)果如表3所示。以△RSCU≥0.08為標(biāo)準(zhǔn)，再結(jié)合葉綠體基因的RSCU>1確定最優(yōu)密碼子，共14個(gè)，分別是UCU、UGU、UUA、UUG、UAG、CCU、CGU、CGA、AUU、ACU、AGU、ACC、AAA、AGA、GCU、GGU、GUA和GCA。其中8個(gè)以U結(jié)尾，5個(gè)以A結(jié)尾，1個(gè)以G結(jié)尾，說(shuō)明最優(yōu)密碼子多以A/U結(jié)尾。

2. 7 無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育分析

基于葉綠體基因組序列，以天門冬科（Asparagaceae）綿棗兒屬（Barnardia）植物綿棗兒（B. japonica）為外類群，構(gòu)建無(wú)刺龍舌蘭在內(nèi)的21種龍舌蘭科植物的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，如圖7所示。除外類群綿棗兒之外，龍舌蘭科15個(gè)屬的植物按進(jìn)化關(guān)系遠(yuǎn)近可分為7個(gè)分支，其中絲蘭屬（Yucca）（Clade I）、玉簪屬（Hosta）（Clade IV）和知母屬（Anemarrhena）（Clade VI）植物各單獨(dú)分為一支，與其他屬的親緣關(guān)系較遠(yuǎn);龍舌蘭屬（Agave）、龍薈蘭屬（Beschorneria）和龍香玉屬（Manfreda）植物聚為一支（Clade II）;皂百合屬（Chlorogalum）、糠米百合屬（Camassia）、夕麗花屬（Hesperocallis）、西絲蘭屬（Hesperoyucca）和草絲蘭屬（Hesperaloe）植物聚為一支（Clade III）;擬菝葜屬（Behnia）和吊蘭屬（Chlorophytum）植物聚為一支（Clade V），虎尾蘭屬（Sansevieria）和龍血樹(shù)屬（Dracaena）植物聚為一支（Clade VII），說(shuō)明聚為一支的各屬植物之間親緣關(guān)較近。在7種絲蘭屬植物中，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)以100%的自薦值（Bootstrap values）支持無(wú)刺龍舌蘭（Y. treculeana）與克雷塔羅絲蘭（Y. queretaroensis）和西地格絲蘭（Y. schidigera）聚為一小支，互為姊妹關(guān)系，說(shuō)明三者的遺傳距離較小，共同起源較接近。

3 討論

研究表明，被子植物葉綠體基因組長(zhǎng)度一般為120～220 kb，包含大約130個(gè)基因，LSC、SSC和IR區(qū)的長(zhǎng)度分別為81～90、18～20和20～29 kb（Zhang et al.，2012）。本研究無(wú)刺龍舌蘭葉綠體全基因組長(zhǎng)度為157579 bp，總基因數(shù)為135個(gè)，共分為L(zhǎng)SC、SSC和IR（包括IRa和IRb）的長(zhǎng)度分別為85940、18279和26680 bp，與被子植物葉綠體基因組特征（Zhang et al.，2012）相似。假基因（通常用符號(hào)ψ表示）是基因組中與CDS相似的非功能基因組DNA拷貝，多存在于真核生物，于1977年在研究爪蟾核糖體5S RNA基因時(shí)被首次發(fā)現(xiàn)（Xie et al.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組LSC區(qū)的atpB基因第111位點(diǎn)的C突變?yōu)镚，第462位點(diǎn)缺失1個(gè)A，導(dǎo)致atpB基因無(wú)法正常翻譯成氨基酸序列，造成了atpB基因的假基因化。關(guān)于該基因的假基因化并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，僅Malinova（2021）在研究月見(jiàn)草（Oenothera）質(zhì)體突變體I-iota時(shí)發(fā)現(xiàn)atpB基因編碼區(qū)的第11位點(diǎn)有一個(gè)攜帶腺嘌呤A的插入，而葉綠體基因中的翻譯重編碼可糾正atpB基因的移碼突變。

堿基組成的差異會(huì)引起同義密碼子的非均衡使用現(xiàn)象（胡曉艷等，2019）。研究表明，密碼子第3位上的堿基突變不改變氨基酸類型且受選擇壓較小，因此，GC3常被用作分析密碼子使用模式的重要依據(jù)（Tang et al.，2020）。本研究PR2-plot分析結(jié)果顯示，無(wú)刺龍舌蘭葉綠體CDS在密碼子第3位上，T>A，C>G，與酸棗（胡曉艷等，2019）、向日葵（Helianthus annuus）（Chen et al.， 2021）等植物的研究結(jié)果一致，但與蘇鐵（Cycas revoluta）（Zhou et al.，2008）、燈盞花（李顯煌等，2021）等植物的研究結(jié)果存在差異，即蘇鐵和燈盞花葉綠體CDS序列在密碼子第3位上出現(xiàn)了T>A，C>G且A、T與 G、C的使用頻率相當(dāng)?shù)那闆r，存在差異的原因可能與植物進(jìn)化速率及環(huán)境型有關(guān)。對(duì)多數(shù)植物而言，自然選擇和突變是造成其密碼子偏好性的主要?jiǎng)恿Γ∕usto， 2016）。植物葉綠體基因組密碼子使用偏好性雖受選擇、突變等多重因素的影響，但主要影響因素只有1～2種（Zhang et al.，2018）。本研究利用中性繪圖、ENC-plot和PR2-plot對(duì)造成無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組密碼子偏好性的原因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變和選擇是導(dǎo)致無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組密碼子偏性的主要影響因素，與龍舌蘭屬植物劍麻（金剛等，2018）的研究結(jié)論一致，說(shuō)明選擇和突變對(duì)密碼子偏好性的影響在親緣關(guān)系較近的植物中較一致，可能與物種的遺傳進(jìn)化有關(guān)。沈宗芳等（2021）在3種槲蕨屬植物葉綠體基因組密碼子偏好性分析研究中也得出相同結(jié)論。另外，關(guān)于物種遺傳距離遠(yuǎn)近與密碼子使用偏好性之間是否存在一定關(guān)系的問(wèn)題，各學(xué)者所持觀點(diǎn)不同（Tang et al.，2021），如Somaratne等（2019）通過(guò)對(duì)2種親緣關(guān)系較近的胡枝子屬（Desmodieae）植物葉綠體基因組進(jìn)行序列差異及密碼子使用模式分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近與密碼子使用模式相關(guān)，即親緣關(guān)系越近，其密碼子使用模式也會(huì)越相似。目前，有關(guān)絲蘭屬植物密碼子使用偏好性的研究較少，探究密碼子使用模式與物種的親緣關(guān)系是否存在相關(guān)性還需要對(duì)屬內(nèi)各物種的密碼子偏性進(jìn)行深入研究。

大量研究表明，植物葉綠體基因組具有結(jié)構(gòu)完整性和序列保守性，因此，在植物分類、系統(tǒng)進(jìn)化的研究中優(yōu)勢(shì)突出（Parks et al.，2009）。目前，直接利用葉綠體基因組構(gòu)建龍舌蘭科植物的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的研究報(bào)道較少，僅Kate和Mark（2013）對(duì)蛇紋石土壤上特有植物進(jìn)行分類研究時(shí)，首次利用葉綠體基因組對(duì)龍舌蘭科部分植物進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系探究。另外，在龍舌蘭科植物自花授粉起源的研究中，McKain等（2016）基于葉綠體基因組構(gòu)建了最大似然（ML）樹(shù)和貝葉斯（Bayes）樹(shù)，初步明確了屬間的授粉起源關(guān)系，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示西地格絲蘭和克雷塔羅絲蘭為姊妹關(guān)系，且同與短葉絲蘭聚為絲蘭屬一支，無(wú)論是絲蘭屬的4種植物間，還是其余各屬之間，其分支結(jié)果均與本研究的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分支結(jié)果一致。因此，在物種的分類鑒定及確定各物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究中，基于植物葉綠體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)是一種準(zhǔn)確、可靠的方法。

4 結(jié)論

無(wú)刺龍舌蘭葉綠體基因組為保守的四分體結(jié)構(gòu)，葉綠體基因組密碼子偏好性較弱，主要受選擇和突變等多因素影響。基于植物葉綠體基因組構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)在物種的分類鑒定及確定各物種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究中是一種準(zhǔn)確、可靠的方法。

參考文獻(xiàn)：

段義忠，張凱. 2020. 沙冬青屬植物葉綠體基因組對(duì)比和系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，40（8）：1323-1332. [Duan Y Z，Zhang K. 2020. Comparative analysis and phylogenetic evolution of the complete chloroplast genome of Ammopiptanthus[J]. Northwestern Journal of Botany，40（8）：1323-1332.]doi：10.7606/j.issn.1000-4025.2020.08. 1323.

高亞芳，劉瑩瑩，楊從衛(wèi)，李國(guó)棟，錢子剛. 2019. 金鐵鎖葉綠體基因組序列及其系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 中草藥，50（22）：5532-5536. [Gao Y F，Liu Y Y，Yang C W，Li G D，Qian Z G. 2019. Analysis on structure and phylogeny of complete chloroplast genomes in Psammosilene tunicoides[J]. Chinese Herbal Medicine，50 （22）：5532-5536.]doi：10.7501/j.issn.0253-2670.2019.22.022.

惠小涵，程婷婷，柯衛(wèi)東，郭宏波. 2020. 蓮藕PPO基因密碼子偏好性特征分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，36（2）：438-446. [ Hui X H，Cheng T T，Ke W D，Guo H B. 2020. Analysis on codon preference of PPO gene in lotus root[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，36（2）：438-446.]doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2020.02.026

胡曉艷，許艷秋，韓有志，杜淑輝. 2019. 酸棗葉綠體基因組密碼子使用偏性分析[J]. 森林與環(huán)境學(xué)報(bào)，39（6）：621-628. [Hu X Y，Xu Y Q，Han Y Z，Du S H. 2019. Codon usage bias analysis of the chloroplast genome of Ziziphus jujuba var. Spinosa[J]. Journal of Forest and Environment，39（6）：621-628.] doi：10.13324/j.cnki.jfcf.2019. 06.009.

金剛，覃旭，龍凌云，王麗萍，覃劍峰，危丹妮，陳濤，蔡中全. 2018. 劍麻葉綠體基因組編碼序列密碼子的使用特征[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），47（6）：705-710. [Jin G，Qin X，Long L Y，Wang L P，Qin J F，Wei D N，Chen T，Cai Z Q. 2018. Characteristics of codon usage in the chloroplast protein-coding genes of Agave hybrid No.11648[J]. Journal of Fujian Agriculture & Forestry University （Natural Science Edition），47（6）：705-710.] doi：10.13323/j.cnki.j.fafu（nat.sci.）.2018.06.011.

李江飛，原曉龍，李熙顏，王瑜，蔡年輝，陳詩(shī)，許玉蘭. 2021. 永椿香槐葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 分子植物育種，https：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.2021 0630.1627.017.html. [Li J F，Yuan X L，Li X Y，Wang Y，Cai N H，Chen S，Xu Y L. 2021. Analysis on codon usage bias of chloroplast genome in Cladrastis yungchunii[J]. Molecular Plant Breeding，https：//kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210630.1627.017.html.]

李顯煌，楊生超，辛雅萱，屈亞亞，楊琳懿，馮發(fā)玉，范偉，辛培堯. 2021. 燈盞花葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），36（3）：384-392. [Li X H，Yang S C，Xin Y X，Qu Y Y，Yang L Y，F(xiàn)eng F Y，F(xiàn)an W，Xin P Y. 2021. Analysis of the codon usage bias of chloroplast genome in Erigeron breviscapus（Vant.） Hand-Mazz[J]. Journal of Yunnan Agricultural University（Natural Science），36 （3）：384-392.] doi：10.12101/j.issn. 1004-390X（n）.202010007.

牛元，徐瓊，王崳德，代立蘭，莊健，趙亞蘭. 2018. 大花香水月季葉綠體基因組密碼子使用偏性分析[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，33（3）：123-130. [Niu Y，Xu Q，Wang Y D，Dai L L，Zhuang J，Zhao Y L. 2018. An analysis on codon usage bias of the chloroplast genome of Rosa odorata var. Gigantea[J]. Journal of Northwest Forest College，33 （3）：123-130.] doi：10.3969/j.issn.1001-7461.2018.03.19.

屈亞亞，辛靜，馮發(fā)玉，董章宏，瞿紹宏，王海洋，李斌，辛培堯. 2021. 香花枇杷質(zhì)體基因組序列密碼子偏性分析[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，5（4）：1-8. [Qu Y Y，Xin J，F(xiàn)eng F Y，Dong Z H，Qu S H，Wang H Y，Li B，Xin P Y. 2021. Condon usage bais in chloroplast genome of Eriobotrya fragrans Champ. Ex Benth[J]. Journal of Northwest Forest College，5（4）：1-8.] doi：10.3969/j.issn.1001-7461.2021.04.20.

沈宗芳，陸添權(quán)，張志榮， 蔡傳濤，田波. 2021. 槲蕨屬葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 廣西植物，41（2）：266-273. [Shen Z F，Lu T Q，Zhang Z R，Cai Z T，Tian B. 2021. Condon bias of chloroplast genome of Drynaria[J]. Guangxi Plant，41（2）：266-273.] doi：10.11931/guihaia.gxzw201904013.

辛雅萱，黎若竹，李鑫，陳麗瓊，唐軍榮，屈亞亞，楊琳懿，辛培堯，李云芳. 2021. 杧果葉綠體基因組密碼子使用偏好性分析[J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，（9）：148-156. [Xin Y X，Li R Z，Li X，Chen L Q，Tang J R，Qu Y Y，Yang L Y，Xin P Y，Li Y F. 2021. Analysis on codon usage bias of chloroplast genome in Mangifera indica[J]. Journal of Central South University of Forestry and Technology，（9）：148-156.] doi：10.14067/j.cnki.1673-923x.2021.09.016.

原曉龍，劉音，康洪梅，陳中華，李云琴，王毅. 2021. 蒜頭果葉綠體基因組密碼子偏好性分析[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)），41（3）：15-22. [Yuan X L，Liu Y，Kang H M，Chen Z H，Li Y Q，Wang Y. 2021. Analysis of codon usage bias in chloroplast genome of Malania oleifera[J]. Journal of Southwest Forestry University （Natural Sciences），41（3）：15-22.] doi：10.11929/j.swfu.2020 01047.

Chen S Y，Zhang H，Wang X，Zhang Y H，Ruan G H，Ma J. 2021. Analysis of codon usage bias in the chloroplast genome of J-01[J]. IOP Conference Series：Earth and Environmental Science，792（1）：1755. doi：10.1088/1755-1315/792/1/012009.

Irish G. 2000. Agaves，Yuccas，and related plants：A gardener’s guide[M]. Portland ：Timber Press.

Jansen R K，Uhlman R. 2012. Plastid genomes of seed plants. genomics of chloroplasts and mitochondria[M]. Dordrecht：Springer.

Jiang Y，Deng F，Wang H L，Hu Z H. 2008. An extensive analysis on the global codon usage pattern of baculoviruses[J]. Archives of Virology，153（12）：2273. doi：10. 1007/s00705-008-0260-1.

Jia-Yee S，Thore R，Abigail G，Hannah M P，Wendy G，Annie Y，Marc R，Sven K D. 2015. Complete chloroplast genome of the Wollemi Pine （Wollemia nobilis ）：Structure and evolution[J]. Public Library of Science，10（6）：126-128. doi：10.1371/journal.pone.0128126.

Jin J J，Yu W B，Yang J B，Song Y，Yi T S，Li D Z. 2020. GetOrganelle：A fast and versatile toolkit for accurate de novo assembly of organelle genomes[J]. Genome Biology，21（1）：241. doi：10.1186/s13059-020-02154-5.

Kai J，Song X Q，Chen C G. 2020. Coons for the chloroplast genome of the Magnoliaceae use trait analysis[J]. China Agricultural Science and Technology Herald，22（11）：52-62.

Kate H，Mark F. 2013. A chloroplast phylogeny of agavaceae subfamily Chlorogaloideae：Implications for the Tempo of Evolution on Serpentine Soils[J]. Systematic Botany，38（4）：674. doi：10.1600/036364413X674850.

Katoh K，Standley D M. 2013. MAFFT multiple sequence alignment software version 7：Improvements in performance and usability[J]. Molecular Biology and Evolution，30（4）：772-780. doi：10.1093/molbev/mst010.

Kearse M，Moir R，Wilson A. 2012. Geneious Basic：An integrated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data[J]. Bioinformatics，28（12）：1647-1649. doi：10.1093/bioinformatics/bts199.

Li G L，Pan Z L，Gao S C，He Y Y，Xia Q Y，Jin Y，Yao H P. 2019. Analysis of synonymous codon usage of chloroplast genome in Porphyra umbilicalis[J]. Genes Geno-mics，10（41）：1173-1181. doi：10.1007/s13258-019-00847-1.

Lohse M，Drechsel O，Kahlau S. 2013. Organellar genome DRAW—A suite of tools for generating physical maps of plastid and mitochondrial genomes and visualizing expression data sets[J]. Nucleic Acids Research，（41）：575-581. doi：10.1093/nar/gkt289.

Long S，Yao H，Wu Q，Li G L. 2018. Analysis of compositional bias and codon usage pattern of the coding sequence in Banna virus genome[J]. Virus Research，（10）：1016. doi：10.1016/j.virusres.2018.10.006.

Malinova I，Zupok A，Massouh A，Meyer E H，Greiner S. 2021. Correction of frameshift mutations in the atpB gene by translational recoding in chloroplasts of Oenothera and tobacco[J]. The Plant Cell，33（5）：1-24. doi：10.1093/PLCELL/KOAB050.

McKain M R，McNeal J R，Kellar P R. 2016. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae（Asparagaceae）[J]. American Journal of Botany，103（10）：1717-1729.

Musto H. 2016，What we know and what we should know about codon usage[J]. Journal of Molecular Evolution，82（6）：245-246. doi：10.1007/s00239-016-9742-z.

Parks M，Cronn R，Liston A. 2009. Increasing phylogenetic resolution at low taxonomic levels using massively parallel sequencing of chloroplast genomes[J]. BMC Developmental Biology，12（7）：84.

Somaratne Y，Guan D L，Wang W Q，Zhao L，Xu S Q. 2019. The complete chloroplast genomes of two Lespedeza species：Insights into codon usage bias，RNA editing sites，and phylogenetic relationships in Desmodieae （Fabaceae：Papilionoideae）[J]. Plants，9（1）：3390. doi：10.3390/plants 9010051.

Stamatakis A，Hoover P，Rougemont J. 2008. A rapid bootstrap algorithm for the RAxML web servers[J]. Systema-tic Biology，57（5）：758-771. doi：10.1080/1063515080242 9642.

Sueoka N. 2017. Near homogeneity of PR2-bias fingerprints in the human genome and their implications in phylogenetic analyses[J]. Journal of Molecular Evolution，19（53）：469-476.

Tang D F，Wei F，Cai Z Q，Wei Y Y，Khan A，Miao J H，Wei K H. 2020. Analysis of codon usage bias and evolution in the chloroplast genome of Mesona chinensis Benth[J].Development Genes and Evolution，（10）：1007. doi：10. 1007/s00427-020-00670-9.

Tang Y J，Zhao Y，Huang G D. 2021. Mangifera indica L. chloroplast genome codon using preference analysis[J]. Journal of Tropical Crop Science，7：1-11.

Tao X L，Ma L C，Zhang Z S，Liu W X，Liu Z P. 2017. Characterization of the complete chloroplast genome of alfalfa （Medicago sativa） （Leguminosae）[J]. Gene Reports，（6）：1-6. doi：10.1016/j.genrep.2016.12.006.

Tillich M，Lehwark P，Pellizzer T，Ulbricht-Jones E S，F(xiàn)ischer A，Bock R，Greiner S. 2017. GeSeq-versatile and accurate annotation of organelle genomes[J]. Nucleic Acids Research，45（7）：6-11. doi：10.1093/nar/gkx391.

Wang H，Meng T，Wei W. 2018. Analysis of synonymous codon usage bias in helicase gene from Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus[J]. Genes & Genomi-cs，（40）：767-780. doi：10.1007/s13258-018-0689-x.

Wei L，He J，Jia X，Qi Q. 2014. Analysis of codon usage bias of mitochondrial genome in Bombyx mori and its relation to evolution[J]. BMC Evolutionary Biology，（14）：262. doi：10.1186/s12862-014-0262-4.

Windarti C K，Maryanto A E，Salamah A. 2021. The study of heat shock protein 70 （Hsp70） gene expression on Agera-tum conyzoides L. and Synedrella nodiflora L. in Universitas Indonesia，Depok and Cibodas Botanical Garden[J]. Journal of Physics：Conference Series，1725（1）：012059. doi：10.1088/1742-6596/1725/1/012059.

Wu M L，Chen S P，Chen H. 2019. Condon preference of chloroplast genome of Bambusoideae[J]. Journal of Environmental Quality，（1）：9-14. doi：10.13324/j.cnki.jfcf.2019.01.002.

Xie J B，Li Y，Liu X M，Zhao Y Y，Li B L，Ingvarsson P K，Zhang D Q. 2019. Evolutionary origins of pseudogenes and their association with regulatory sequences in plants[J]. The Plant Cell，31（3）：601-619. doi：10.1105/tpc. 18.00601.

Xu C，Cai X，Chen Q. 2011. Factors affecting synonymous codon usage bias in chloroplast genome of Oncidium gower ramsey[J]. Evolutionary Bioinformatics，10（7）：271-278. doi：10.4137/EBO.S8092.

Yang G F，Su K L，Zhao Y R. 2015. Analysis of codon usage in the chloroplast genome of Medicago truncatula[J]. Acta Pharmacologica Sinica，6（12）：171-179.

Zhang R，Zhang L，Wang W. 2018. Differences in codon usage bias between photosynthesis related genes and genetic system-related genes of chloroplast genomes in cultivated and wild Solanum species[J]. International Journal of Molecular Sciences，（19）：3142. doi：10.3390/ijms 19103142.

Zhang T W，F(xiàn)ang Y J，Wang X M，Deng X，Zhang X W，Hu S N，Yu J. 2012. The complete chloroplast and mitochondrial genome sequences of Boea hygrometrica：Insights into the evolution of plant organellar genomes[J]. Public Library of Science，7（1）：e30531. doi：10.1371/journal.pone.0030531.

Zhou M，Long W，Li X. 2008. Patterns of synonymous codon usage bias in chloroplast genomes of seed plants[J]. Fore-stry Studies in China，10（4）：235-242. doi：10.1007/s11632-008-0047-1.

收稿日期：2021-08-24

基金項(xiàng)目：云南省科技廳科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2018BB005）;西南林業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目（KY21034）

通訊作者：辛培堯（1975-），https：//orcid.org/0000-0001-8512-7083，教授，主要從事植物遺傳育種與快繁研究研究工作，E-mail：xpytgyx@163.com

第一作者：王飛（1996-），https：//orcid.org/ORCID：0000-0002-9117-6620，主要從事林木分子生物學(xué)與遺傳改良研究，E-mail：1767785429@qq.com