蒜芥茄SsWRKY1基因克隆及黃萎病病原菌脅迫下表達分析

尹夢瑩 蔚亞楠 杜光輝 桂敏 黎志彬 鮑銳 龔亞菊 吳麗艷

摘要：【目的】克隆蒜芥茄WRKY1基因（SsWRKY1），并分析其在黃萎病病原菌脅迫下的表達模式，為探究WRKY1基因在野生蒜芥茄黃萎病抗性中的調控機制提供理論參考?！痉椒ā坷萌旧w步移技術克隆SsWRKY1基因，通過在線生物信息學軟件進行序列分析及構建系統發育進化樹;采用GFP融合蛋白表達法對WRKY1蛋白進行亞細胞定位，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測SsWRKY1基因在不同組織及接種黃萎病病原菌后不同時間的相對表達量。并分析9種野生茄材料接種黃萎病病原菌后的病情指數與WRKY1基因表達變化量的相關性?！窘Y果】克隆獲得的SsWRKY1基因（GenBank登錄號MZ846202）ORF序列長度為1224 bp，編碼407個氨基酸殘基，蛋白相對分子量為44.87 kD，理論等電點（pI）為6.91，屬于親水性不穩定蛋白，亞細胞定位于細胞核，符合轉錄因子特征。SsWRKY1蛋白含有2個WRKY保守結構域和C2H2型鋅指結構，屬于Ⅰ類WRKY轉錄因子，其二級結構主要由α-螺旋（7.13%）、β-折疊（4.67%）、無規則卷曲（73.71%）和延伸鏈（14.50%）組成。SsWRKY1蛋白與番茄、野生潘那利番茄、野生番茄、馬鈴薯WRKY1蛋白的親緣關系較近。SsWRKY1基因在根和莖的相對表達量顯著高于葉中的相對表達量（P<0.05，下同）。黃萎病病原菌接種后不同時間，SsWRKY1基因的相對表達量均低于對照組（無菌水接種），但僅在24 h時二者差異達顯著水平。9種野生茄材料接種黃萎病病原菌后的病情指數與接種前后WRKY1基因表達變化量間呈顯著正相關?！窘Y論】SsWRKY1屬于第Ⅰ類WRKY轉錄因子，序列高度保守，在細胞核中表達，其基因具有組織表達特異性，黃萎病菌脅迫后該基因的表達下調，推測WRKY1在野生茄黃萎病抗性中起負調控作用。

關鍵詞： 蒜芥茄;WRKY轉錄因子;黃萎病;基因克隆;亞細胞定位;表達分析

中圖分類號： S641.1;S436.411? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）04-1000-11

Cloning and expression analysis of SsWRKY1 gene in Solanum sisymbriifolium under stress of verticillium wilt disease

YIN Meng-ying1，2， YU Ya-nan1，2， DU Guang-hui2， GUI Min1， LI Zhi-bin1，

BAO Rui1， GONG Ya-ju1*， WU Li-yan1*

（1Horticultural Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Kunming， Yunnan? 650205， China;

2Institute of Resource Plants， Yunnan University， Kunming， Yunnan? 650500， China）

Abstract：【Objective】The WRKY1 gene of Solanum sisymbriifolium （SsWRKY1） was cloned and its expression pattern under the stress of verticillium wilt disease was analyzed to provide a theoretical reference for exploring the regulatory mechanism of WRKY1 gene in the resistance to verticillium wilt. 【Method】SsWRKY1 gene was cloned by the genome walking technique， and its sequence was analyzed by bioinformatics software and a phylogenetic tree was constructed. The subcellular localization of WRKY1 protein was determined by its GFP fusion protein expression under its native promoter. The expression of SsWRKY1 in different tissues of S. sisymbriifolium at different times under verticillium wilt di-sease stress was analyzed by real-time quantitative PCR（qRT-PCR）. The correlation analysis between disease index and WRKY1 gene expression of 9 wild eggplant materials inoculated with the verticillium wilt pathogen was also analyzed. 【Result】The full-length open reading frame（ORF） sequence of SsWRKY1 gene （GenBank accession number：MZ846202） was 1224 bp， encoding 407 amino acids residues. Its protein molecular weight was 44.87 kD and its theoretical isoelectric point （pI） was 6.91， which indicated that SsWRKY1 was a hydrophilic and unstable protein. Its subcellular localization in the nucleus conformed to the characteristics of transcription factors. The SsWRKY1 protein contained two conserved WRKY domains and a C2H2-type zinc finger structure， indicating that SsWRKY1 was a class I WRKY transcription factor. Its secondary structure was mainly composed of α-helix （7.13%）， β-bridge （4.67%）， random coil （73.71%） and exten-ded strand （14.50%）. S. sisymbriifolium was closely related to S. lycopersicum， S. pennellii， S. arcanum and S. tuberosum. The relative expression of SsWRKY1 in roots and stems was significantly higher than that in leaves （P<0.05，the same below）. The relative expression of SsWRKY1 at different times after the inoculation of the verticillium wilt pathogen was lower than that of the control group （sterile water inoculation）， but the difference was significant at 24 h. There was a significant positive correlation between disease index and the variation in WRKY1 expression in 9 wild eggplant materials ino-culated with verticillium wilt pathogen. 【Conclusion】SsWRKY1 belongs to the class I of WRKY transcription factors， its sequence is highly conserved and is expressed in the nucleus. The gene expression of SsWRKY1 is tissue-specific and the expression of this gene decreased under verticillium wilt disease stress. SsWRKY1 gene may play a negative regulatory role in wild eggplant resistance to verticillium wilt.

Key words：Solanum sisymbriifolium;WRKY transcription factor;verticillium wilt;gene cloning;subcellular loca-lization;gene expression analysis

Foundation items：National Natural Science Foundation of China Regional Fund Project （31960594）;Yunnan Applied Basic Research Project （2019FB059）;Yunnan Joint Foundation for Agricultural Basic Research （2018FG001-022）

0 引言

【研究意義】黃萎病（Verticillium wilt）是由輪枝菌（Verticillium spp.）引起的一種土傳性植物維管束病害，其病原菌微菌核在沒有寄主存在的條件下，可在土壤中存活十幾年之久，加之其形態和致病力易發生變異使得黃萎病防控日益復雜（Fradin and Thomma，2010;Inderbitzin et al.，2011），被稱作植物的“癌癥”。目前茄子黃萎病抗病材料主要為近緣野生種和半栽培種（莊勇和王述彬，2009）。我國云南省及周邊地區蘊藏著豐富的黃萎病抗性野茄種質資源（鄭殿升等，2013），其中，蒜芥茄（Solanum sisymbriifolium）具有較強的黃萎病抗性（Collonnier et al.，2001;郭堂勛等，2015;吳麗艷等，2017），但其抗性基因尚未被挖掘利用。WRKY轉錄因子是植物所特有的一類轉錄因子，在植物抗病防御反應中發揮重要的調控作用（Pandey and Somssich，2009），但在野茄抗黃萎病過程中的研究甚少。因此，克隆蒜芥茄WRKY基因并分析其表達特性，對深入探究該基因在蒜芥茄抗黃萎病過程中的生物學功能及調控機制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】WRKY轉錄因子在植物逆境應答中發揮重要作用。Dang等（2014）研究發現，煙草中過表達辣椒CaWRKY27基因能增強煙草對青枯病菌的抗性;Warren等（2020）研究發現，將芍藥PlWRKY65基因沉默后，植株對細鏈孢霉感染更敏感;Long等（2021）研究認為，甜橙CsWRKY22基因表達可降低其植株對潰瘍病的抗性;劉開等（2021）研究發現，茄子SmWRKY65基因可能參與植株青枯病抗性調控;Freeboroug等（2021）研究發現，木薯MeWRKY81基因參與對木薯花葉病毒的負調控因子。WRKY1作為較早被發現的WRKY轉錄因子之一，在植物抗逆反應中也發揮著重要作用。如番茄LpWRKY1和辣椒CaWRKY1轉錄因子均被證明參與植物防御反應（Hofmann et al.，2008;Oh et al.，2008），且番茄LpWRKY1轉錄因子在番茄抗晚疫病過程中發揮正向調節作用（Cui et al.，2019）;草莓FaWRKY1轉錄因子是介導植株對尖孢炭疽病菌防御反應的重要因子，能負調控果實對尖孢炭疽病的抗性（Sonia et al.，2009;Higuera et al.，2019）;蘋果輪紋病病原菌能誘導湖北海棠中MhWRKY1基因的表達，推測該基因參與防御輪紋病病原菌侵入的響應（張計育等，2011）;棉花GbWRKY1轉錄因子是一個關鍵的調節因子，能負調控棉花對灰霉病菌和大麗輪枝菌抗性（Li et al.，2014）;煙草中過表達SpWRKY1基因能顯著提高植株對煙草疫霉的抗性（Li et al.，2015）;葡萄VvWRKY1基因可增強植株對霜霉病的抗性（Marchive et al.，2018）;水茄StWRKY-1基因在擬南芥中誘導表達后，擬南芥對茄子黃萎病表現出抗性（李笑等，2018）;擬南芥AtWRKY1基因能負調控丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000，Pst DC3000）的響應（Fang et al.，2021）?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期基于轉錄組測序數據對蒜芥茄在黃萎病抗病過程中的主要差異基因、代謝通路等進行深入分析，結果發現接種黃萎病病原菌后，WRKY1同源基因在蒜芥茄中顯著上調表達，推測該基因可能在蒜芥茄黃萎病抗病中發揮重要作用。【擬解決的關鍵問題】以蒜芥茄為材料，利用染色體步移技術（Genome Walking）克隆出蒜芥茄WRKY1基因（SsWRKY1）（GenBank登錄號MZ846202），對其進行生物信息學分析，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測其在蒜芥茄不同組織（根、莖、葉）及接種黃萎病病原菌后不同時間的相對表達量，并對9種野生茄材料接種黃萎病病原菌24 h后WRKY1基因的表達情況與其病情指數進行相關分析，為探究WRKY1基因在野生蒜芥茄黃萎病抗性中的調控機制提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試的9種野生茄材料（表1）種植于云南省農業科學院園藝作物研究所試驗基地內。黃萎病致病菌株大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.）由本課題組保存提供。主要試劑：廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒（DL116-01）購自北京博邁德基因技術有限公司;植物RNA提取試劑盒（R6827）購自OMEGA公司，GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒、2 ×TSINGKE Master qPCR Mix qPCR Mix（SYBR Green Ⅰ）試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態細胞和農桿菌GV3101感受態細胞購自北京擎科生物科技有限公司;KOD FX高保真PCR酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司;2 ×Biorun Pfu PCR Mix酶購自武漢伯遠生物科技有限公司;T4 DNA連接酶和限制性內切酶購自北京全式金生物技術有限公司;pMD19-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司。主要設備儀器：CFX96TM Realtime System熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）、T100TM PCR儀（美國Bio-Rad公司）、NanoDrop 超微量核酸蛋白分析儀（德國Implen公司）、ChemiDoc XRS+凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）、頂置LED人工氣候箱（武漢伯遠生物科技有限公司）和徠卡正置熒光顯微鏡（德國Leica公司）。

1. 2 材料處理及取樣

于4片真葉期選取生長狀態良好的蒜芥茄植株，分別對其不同組織部位（根、莖、葉）進行取樣，液氮速凍，儲存于-80 ℃超低溫冰箱，用于SsWRKY1基因在蒜芥茄不同組織中的表達分析。

參考吳麗艷等（2017）的方法，于4片真葉期利用浸根法對蒜芥茄進行病原菌人工接種，以無菌水處理為對照，分別處理0、24 、48和72 h后，取其根部，待洗凈并擦干后液氮速凍，于-80 ℃超低溫冰箱，用于SsWRKY1基因在蒜芥茄接種黃萎病病原菌后不同時間的表達分析。

采用上述相同的方法進行野生茄材料人工接種及取樣，用于WRKY1基因表達情況與其病情指數的相關分析。根據SsWRKY1基因在蒜芥茄接種黃萎病病原菌后不同時間的表達分析結果得到該基因表達量差異最大的時間點，取部分植株葉片，并參考吳麗艷等（2017）的方法統計剩余植株的抗病性和病情指數。以上每個材料均設3次重復，每次重復10株植株。

1. 3 SsWRKY1基因克隆

1. 3. 1 基因組DNA提取 按照廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒說明提取蒜芥茄根部基因組DNA。

1. 3. 2 采用染色體步移技術擴增SsWRKY1基因編碼區（CDS）序列 根據前期轉錄組測序得到的不完整CDS序列，利用Primer 5.0設計3條特異引物SP1-R、SP2-R和SP3-R（表2）。以蒜芥茄基因組DNA為模板，以簡并引物LAD1-F/LAD2-F/LAD3-F/LAD4-F與特異引物SP1-R配對進行第1次巢式PCR，擴增程序：95 ℃預變性90 s;95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min;94 ℃ 10 s，25 ℃ 2 min，72 ℃ 2 min;進行15個循環（94 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min;94 ℃ 10 s，62 ℃ 30s，72 ℃ 2 min;94 ℃ 10 s，44 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min）;72 ℃延伸5 min。以第1次巢式PCR產物為模板，以特異引物SP2與簡并引物AC-F配對，進行第2次巢式PCR;以第2次巢式PCR產物為模板，以特異引物SP3與簡并引物AC-F配對，進行第3次巢式PCR，第2、3次PCR擴增程序相同，均為：95 ℃預變性90 s;94 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，進行30個循環;72 ℃預變性5 min。反應體系25.0 μL：模板1.0 μL，2×KOD1 PCR Mix 0.5 μL，dNTP Mix 5.0 μL，10 × Buffer 12.5 μL，10.0 μmol/L 上、下游引物各1.0 μL，ddH2O補充至25.0 μL。

利用1%瓊脂糖凝膠電泳分別對第2、3輪PCR產物進行檢測，待目的片段檢測確認后，對其進行回收、純化并連接至pMD19-T載體上，將重組載體轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，經菌落PCR鑒定后，選取符合要求的陽性質粒送至昆明擎科生物科技有限公司測序。

1. 4 生物信息學分析

使用NCBI數據庫的ORFfinder查找SsWRKY1基因的開放閱讀框（ORF），利用ProtParam對SsWRKY1蛋白的理化性質進行預測;利用Cell-PLoc 2.0對蛋白進行亞細胞定位，利用ProtScale對蛋白的親/疏水性進行預測;利用SOPMA對蛋白的二級結構進行預測，同時利用SWISS-MODEL對蛋白的三級結構進行預測;在NCBI數據庫中通過BLAST搜索與SsWRKY1蛋白同源序列，利用DNAMAN 9.0進行同源比對，最后利用MEGA X的鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統發育進化樹（1000次重復，其他為默認設置）。

1. 5 亞細胞定位試驗

利用Primer 5.0設計攜帶Aar Ⅰ酶切位點的特異性引物SsWRKY1-F-AarⅠ/SsWRKY1-R-AarⅠ（表2），以蒜芥茄DNA為模板進行PCR擴增。反應體系50.0 μL：Biorun Pfu PCR Mix 25.0 μL，10 μmol/L正、反向引物（SsWRKY1-F-AarⅠ和SsWRKY1-R-AarⅠ）各2.0 μL，cDNA模板1.0 μL，Nuclease-free H2O 20.0 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 45 s，72 ℃ 73 s，進行30個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。然后用AarⅠ內切酶對擴增產物進行酶切，用BsaⅠ和Eco31Ⅰ對pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp載體進行雙酶切，經純化回收后用T4連接酶連接，從而構建pBWA（V）HS-SsWRKY1-GLosgfp融合表達載體。

采用液氮法將空載體pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp（陰性對照）和重組載體WA（V）HS-SsWRKY1-GLosgfp轉化農桿菌GV3101。隨后在YEP固體培養基（含100 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平）上進行陽性克隆篩選。挑取單克隆至YEP液體培養基中過夜培養（28 ℃，220 r/min），經菌液PCR檢測為陽性后繼續培養至OD600 nm=0.6時收集菌體。

利用含有100 μmol/L乙酰丁香酮、10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸和10 mmol/L氯化鎂的懸浮液對收集菌體進行重懸，并調至重懸菌液OD600 nm=0.2后室溫孵育4 h。通過瞬時表達法將重懸菌液注射至本氏煙草葉片，隨后置于恒溫培養箱（光照16 h/黑暗8 h）中培養48 h。然后用1 μg/mL DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）染色劑對注射菌液的葉片進行染色處理。最后，利用正置熒光顯微鏡觀察煙草細胞中綠色熒光蛋白（GFP）熒光信號的分布情況。

1. 6 蒜芥茄及其他野茄材料中WRKY1基因表達分析

RNA提取參照植物RNA提取試劑盒說明進行操作。總RNA按照GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit試劑盒的方法反轉錄合成cDNA第一鏈。根據目的基因的cDNA序列設計qRT-PCR引物SsWRKY1-F/ SsWRKY1-R（表2），以CYP為內參基因，利用2×TSINGKE Master qPCR Mix qPCR Mix（SYBR Green Ⅰ）試劑盒對WRKY1基因進行表達分析。每處理重復3次，以無菌水接種處理為對照。

1. 7 統計分析

使用Excel 2016對試驗數據進行整理分析。WRKY1基因的相對表達量采用2-△△Ct法進行計算，通過SPSS 22.0進行單因素方差分析，并使用GraphPad Prism 8制圖。參照吳麗艷等（2017）的病情調查方法及種質群體抗性分級標準對9種野茄材料進行黃萎病抗性鑒定，利用雙變量-Spearman法對基因表達變化量和病情指數進行相關分析。

2 結果與分析

2. 1 SsWRKY1基因克隆及序列分析結果

經3輪PCR擴增后獲得約1500 bp條帶（圖1）。將其測序結果提交至NCBI數據庫，利用ORFfinder查找ORF，結果顯示該序列包含SsWRKY1基因（GenBank登錄號MZ846202）完整的ORF，長度為1224 bp，編碼407個氨基酸殘基（圖2）。

2. 2 SsWRKY1蛋白系統發育分析及多重序列比對結果

從NCBI數據庫中搜索出10種已知植物的WRKY1蛋白序列，并利用MEGA X對SsWRKY1蛋白序列進行系統發育進化分析，結果（圖3）顯示，SsWRKY1蛋白和番茄（S. lycopersicum）、野生潘那利番茄（S. pennellii）、野生番茄（S. arcanum）及馬鈴薯（S. tuberosum）WRKY1蛋白的親緣關系較近。

氨基酸序列多重比對結果（圖4）顯示，SsWRKY1與其他10種植物氨基酸序列的相似性為75.82%，且與其他植物一樣，蒜芥茄SsWRKY1也具有WRKY功能結構域，序列一致性達100.00%，表明SsWRKY1蛋白的氨基酸序列高度保守，蛋白結構較穩定，暗示其生物學功能與其他植物WRKY1轉錄因子相似。SsWRKY1蛋白含有2個WRKY保守基序，分別存在于CDS的中部和后部，且具有典型的CX4-5CX22-23HX1H鋅指結構（C2H2型），符合Ⅰ類WRKY轉錄因子的特征。

2. 2. 2 SsWRKY1蛋白理化性質及結構預測結果

SsWRKY1蛋白的理論分子量為44.87 kD，分子式為C1908H3051N577O649S13，正電荷殘基總數（Arg+Lys）為56個，負電荷殘基總數（Asp+Glu）為57個，理論等電點（pI）為6.91，推測其為酸性蛋白;不穩定系數為64.67，為不穩定蛋白;親水性系數為-1.125，表明SsWRKY1蛋白為親水性蛋白;Cell-PLoc 2.0預測結果顯示該蛋白亞細胞定位于細胞核上（圖5）。SsWRKY1蛋白二級結構主要由α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲和延伸鏈組成，分別占7.13%、4.67%、73.71%和14.50%（圖6）。蛋白三級結構預測結果如圖7所示。

2. 3 SsWRKY1蛋白亞細胞定位驗證結果

由圖8可知，在含pBWA（V）HS-ccdb-GLosgfp空載體的煙草細胞中，細胞核、細胞質和細胞膜綠色熒光均分布有綠色熒光，但在含pBWA（V）HS-SsWRKY1-GLosgfp融合表達載體的煙草細胞中，僅細胞核均分布有綠色熒光，說明SsWRKY1蛋白亞細胞定位于細胞核上，與Cell-PLoc 2.0預測結果一致，符合轉錄因子特征，證明SsWRKY1蛋白在細胞核中發揮作用和功能。

2. 4 SsWRKY1基因組織表達特性分析結果

由圖9可知，SsWRKY1基因在蒜芥茄根、莖、葉中均有表達，但相對表達量存在明顯差異，其中在根中的相對表達量最高，其次為莖，均顯著高于葉片中的相對表達量（P<0.05，下同）。

2. 5 接種黃萎病病原菌后SsWRKY1基因表達分析結果

利用qRT-PCR檢測SsWRKY1基因在蒜芥茄接種黃萎病病原菌后72 h內的表達情況，結果（圖10）顯示，對照組中SsWRKY1基因的相對表達量呈先升高后降低再升高的變化趨勢，其相對表達量在24 h達最高，48 h降至最低，但在黃萎病病原菌處理組中，SsWRKY1基因的相對表達量呈先降低后升高的趨勢，48 h為SsWRKY1基因相對表達量的最低。同一時間點上，處理組中SsWRKY1基因的相對表達量均低于對照組，其中在24 h時二者差異最大，達顯著水平。因此，24 h時可作為后續野生茄材料WRKY1基因的相對表達量與其病情指數的相關分析取樣時間點。

2. 6 野生茄材料WRKY1基因的相對表達量與病情指數的相關分析結果

對9種野茄材料進行黃萎病抗性鑒定，結果（表3）顯示，蒜芥茄（種質編號197）病情指數為8，屬于高抗材料;180、194、192-1和192-2的病情指數為35～55，屬于中抗材料;121-3-1、121-3-2和245-2-2的病情指數為55～75，屬于感病材料;而239-3-2的病情指數為88，屬于高感材料。利用qRT-PCR檢測9種野生茄材料接種黃萎病病原菌24 h后葉片中WRKY1基因的相對表達量，并計算其與對照組之間的差值（基因表達變化量），結果（表3）顯示，所有植株在接種黃萎病病原菌24 h后體內WRKY1基因的相對表達量較對照組發生變化。利用SPSS 22.0對表達變化量與病情指數進行相關分析，結果（表3）顯示9種野生茄材料的病情指數與接種前后WRKY1基因表達變化量呈顯著正相關，相關系數（R）為0.6890。

3 討論

WRKY轉錄因子在植物復雜的調控網絡中扮演著重要的角色（Rushton et al.，2010），近年來相關研究主要集中在模式植物的基因克隆、蛋白的功能研究，對茄子中WRKY轉錄因子的研究較少。由于本課題組前期轉錄組測序獲得的WRKY1基因CDS序列不完整，為了獲得完整的基因序列，本研究利用染色體步移技術從蒜芥茄克隆獲得SsWRKY1基因完整ORF序列，將其編碼的氨基酸序列與番茄、煙草等其他10種植物的WRKY1蛋白氨基酸序列高度相似，相似性達75.82%，其中WRKY功能結構域的一致性為100.00%，表明本研究克隆結果準確，方法可行，為克隆WRKY基因不完整序列提供技術參考。雖然現已證實WRKY轉錄因子在植物抗病過程中發揮重要作用，但有關WRKY基因及其編碼蛋白的功能在茄子黃萎病抗性中的研究報道較少。本研究以黃萎病高抗材料蒜芥茄為研究對象，克隆得到黃萎病抗性候選基因SsWRKY1，并對其進行生物信息學及表達特征分析，不僅能為后續研究SsWRKY1基因的生物學功能打下基礎，也為其他植物黃萎病抗性相關WRKY基因的挖掘鑒定及利用提供參考依據。

根據WRKY轉錄因子保守結構域的數量和鋅指結構的特征，可將WRKY家族分為3類：Ⅰ類WRKY家族成員含有2個WRKY保守結構域，其鋅指結構類型為C2H2型;Ⅱ和Ⅲ類成員均只含有1個WRKY結構域，但Ⅱ類成員的鋅指結構為C2H2型，Ⅲ類成員的卻是C2HC型（Eulgem et al.，2000）。本研究通過氨基酸序列比對發現，SsWRKY1蛋白的第433～597位和第964～1137位氨基酸各含有1個WRKY保守結構域和1個C2H2鋅指結構，由此推測SsWRKY1屬于Ⅰ類WRKY轉錄因子。研究發現，Ⅰ類WRKY起源最早（Ulker et al.，2004），而Ⅱ類是Ⅰ類WRKY丟失1個WRKY保守結構域形成的（Xie et al.，2005）。由此推測，SsWRKY1基因在蒜芥茄WRKY基因家族成員中起源較早，其與蒜芥茄Ⅱ和Ⅲ類WRKY基因家族成員的關系尚待研究。

較多研究表明，WRKY轉錄因子定位于細胞核內，如番茄SlWRKY6（周濤等，2020）、煙草NtWRKY53（劉萬峰等，2021）和馬鈴薯StWRKY8（薛珍等，2015）。本研究首先通過Cell-PLoc 2.0對SsWRKY1蛋白的亞細胞定位進行預測，結果顯示其可能位于細胞核中。為了進一步驗證預測結果，利用煙草瞬時表達系統對SsWRKY1蛋白進行亞細胞定位驗證，結果發現其確實位于細胞核中，符合轉錄因子特征，表明其可能參與細胞核基因轉錄水平的調控，與上述前人研究結果一致。

研究發現，煙草NtWRKY基因（向小華等，2016）、茄子SmWRKY65基因（劉開等，2021）和甘薯IbWRKY75基因（劉世芳等，2020）在根、莖和葉中均有表達，但不同基因在不同組織中的表達水平不同。qRT-PCR檢測結果顯示，SsWRKY1基因在蒜芥茄根中的相對表達量最高，在葉片中的相對表達量較低，與水茄StWRKY1的表達結果（李笑，2018）一致。目前，已有研究證實，WRKY基因的表達受到各種生物和非生物脅迫因子的誘導（李笑等，2017）。本研究發現，對照組中SsWRKY1基因的相對表達量呈先升高后降低再升高的變化趨勢，2個拐點分別出現在24和48 h，而黃萎病病原菌處理組中，SsWRKY1基因的相對表達量呈先降低再升高的變化趨勢，48 h為SsWRKY1基因相對表達量的最低點。因此，接種后的24和48 h是研究抗黃萎病基因的關鍵時間點，該結論在前人研究（Gayoso et al.，2010;Tan et al.，2015;李笑，2018）中也得到證實。本研究中，由于24 h時SsWRKY1基因相對表達量在處理組與對照組間差異最大，且達到顯著水平，故選擇黃萎病病原菌接種處理24 h作為后續研究SsWRKY1基因在蒜芥茄黃萎病抗病過程中的重要時間節點。此外，本研究對9種野生茄材料接種黃萎病病原菌后的病情指數與WRKY1基因表達變化量進行相關分析，結果顯示二者之間呈顯著正相關，由于病情指數與抗病性呈負相關，因此推測WRKY1基因可能在蒜芥茄抗黃萎病過程中起負調控作用。該研究結果進一步確認了WRKY1基因與植物黃萎病抗性緊密相關。雖然本研究中僅有9種野生茄材料參與相關分析，但其涵蓋了不同黃萎病抗性水平的材料，可在一定程度上反映出WRKY1基因的表達水平與黃萎病抗性之間的關系，為后續篩選抗性基因提供研究思路。

4 結論

SsWRKY1屬于第Ⅰ類WRKY轉錄因子，序列高度保守，在細胞核中表達，其基因具有組織表達特異性，黃萎病菌脅迫后該基因的表達下調，推測WRKY1在野生茄黃萎病抗性中起負調控作用。

參考文獻：

郭堂勛，王益奎，莫賤友，王艷娜，黃穗萍，李其利，唐利華. 2015. 茄子品種資源對黃萎病的抗性鑒定[J]. 南方農業學報，46（11）：1975-1979. [Gou T X，Wang Y K，Mo J Y，Wang Y N，Huang S P，Li L Q，Tang L H. 2015. Resistance identification of eggplant variety resources to verticillium wilt[J]. Journal of Southern Agriculture，46（11）：1975-1979.] doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2015.11.1975.

李笑，成玉富，楊旭. 2017. 茄科植物WRKY轉錄因子的研究進展[J]. 園藝學報，44（1）：170-178. [Li X，Cheng Y F，Yang X. 2017. Research progress of WRKY transcription factors in Solanaceae plants[J]. Acta Horticulturae Sinica，44（1）：170-178.] doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2016-0703.

李笑. 2018. 水茄抗黃萎病相關StWRKY-1基因的克隆與功能分析[D]. 揚州：揚州大學. [Li X. 2018. Cloning and functional analysis of the StWRKY-1 gene from Solanum torvum[D]. Yangzhou：Yangzhou University.]

劉開，余炳偉，李丹丹，陳娜，曹必好. 2021. 茄子SmWRKY65基因克隆及其對青枯病的抗性分析[J]. 廣東農業科學，48（3）：42-52. [Liu K，Yu B W，Li D D，Chen N，Cao B H. 2021. Cloning of SmWRKY65 gene and its resistance to bacterial wilt in eggplant[J]. Guangdong Agricultural Sciences，48（3）：42-52.] doi：10.16768/j.issn.1004-874X. 2021.03.006.

劉世芳，劉霞宇，張潔，劉俊卿，唐銳敏，賀立恒，賈小云. 2020. 甘薯IbWRKY75的克隆、亞細胞定位及表達特性分析[J]. 植物生理學報，56（5）：969-980. [Liu S F，Liu X Y，Zhang J，Liu J Q，Tang R M，He L H，Jia X Y. 2020. Cloning，subcellular localization and expression analysis of IbWRKY75 in Ipomoea batatas[J]. Plant Physiology Journal，56（5）：969-980.]doi：10.13592/j.cnki.ppj.2019.0594.

劉萬峰，蒲文宣，楊愛國，高軍平，王奇，孫明銘，張新要，孫楠，陳凱，王國平，李曉旭. 2021. 普通煙草NtWRKY53基因克隆、鑒定及表達分析[J]. 煙草科技，54（1）：1-9. [Liu W F，Pu W X，Yang A G，Gao J P，Wang Q，Sun M M，Zhang X Y，Sun N，Chen K，Wang G P，Li X X. 2021. Cloning，characterization and expression pattern analysis of NtWRKY53 gene in Nicotiana tabacum[J]. Tobacco Science & Technology，54（1）：1-9.] doi：10.16135/j.issn 1002-0861.2020.0228.

吳麗艷，郭志祥，曾莉，鮑銳，黎志彬，龔亞菊. 2017. 云南野生茄資源黃萎病苗期人工接種抗性鑒定分析[J]. 植物遺傳資源學報，18（6）：1046-1054. [Wu L Y，Gou Z X，Zeng L，Bao R，Li Z B，Gong Y J. 2017. Resistance identification of Yunnan wild eggplant resources to verticillium wilt[J]. Journal of Plant Genetic Resources，18（6）：1046-1054.] doi：10.13430/j.cnki.jpgr.2017.06.007.

向小華，吳新儒，晁江濤，楊明磊，楊帆，陳果，劉貫山，王元英. 2016. 普通煙草WRKY基因家族的鑒定及表達分析[J]. 遺傳，38（9）：840-862. [Xiang X H，Wu X R，Chao J T，Yang M L，Yang F，Chen G，Liu G S，Wang Y Y. 2016. Genome-wide identification and expression analysis of the WRKY gene family in common tobacco （Nicotiana tabacum L.）[J]. Hereditas，38（9）：840–862.]doi：10.16288/j.yczz.16-016.

薛珍，李卉，孔超越，段婷婷，郜剛. 2015. 受青枯菌誘導表達的馬鈴薯轉錄因子類StWRKY8的克隆與表達分析[J]. 中國農業科學，48（21）：4219-4226. [Xue Z，Li H，Kong C Y，Duan T T，Gao G. 2015. Cloning and expression analy-sis of the potato transcription factor StWRKY8 like gene induced by Ralstonia solanacearum[J]. Scientia Agricultura Sinica，48（21）：4219-4226.] doi：10.3864/j.issn.0578- 1752.2015.21.003.

張計育，佟兆國，高志紅，羅昌國，渠慎春，章鎮. 2011. SA、MeJA、ACC和蘋果輪紋病病原菌誘導湖北海棠MhWRKY1基因的表達[J]. 中國農業科學，44（5）：990-999. [Zhang J Y，Tong Z G，Gao Z H，Luo C G，Qu S C，Zhang Z. 2011. Expression of MhWRKY1 gene induced by the elicitors SA，MeJA，ACC and the apple ring spot pathogen[J]. Scientia Agricultura Sinica，44（5）：990-999.]doi：10.3864/j.issn.0578-1752.2011.05.016.

鄭殿升，高愛農，李立會，劉旭. 2013. 云南及周邊地區農作物野生近緣植物[J]. 植物遺傳資源學報，14（2）：193-201. [Zheng D S，Gao A N，Li L H，Liu X. 2013. Wild relatives of agricultural crop in Yunnan Province and its peripheral area[J]. Journal of Plant Genetic Resources，14（2）：193-201.]doi：10.3969/j.issn.1672-1810.2013.02.001.

周濤，王娟，胡佳蕙，王柏柯，李寧，余慶輝. 2020. 番茄轉錄因子基因SlWRKY6的克隆與原核表達分析[J]. 西北植物學報，40（11）：1824-1832. [Zhou T，Wang J，Hu J H，Wang B K，Li N，Yu Q H. 2020. Cloning and prokaryotic expression analysis of a WRKY transcription factor gene SlWRKY6 in Solanum lycopersicum[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica，40（11）：1824-1832.]doi：10. 7606/j.issn.1000-4025.2020.11.1824.

莊勇，王述彬. 2009. 茄子近緣種黃萎病抗性鑒定及遺傳分析[J]. 江蘇農業學報，25（4）：847-850. [Zhuang Y，Wang S B. 2009. Identification and inheritance of verticillium wilt resistance in eggplant related species[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，25（4）：847-850.]doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2009.04.026.

Collonnier C，Fock I，Kashyap V，Rotino G L，Daunay M C，Lian Y，Mariska I K，Rajam M V，Servaes A，Ducreux G，Sihachakr D. 2001. Applications of biotechnology in eggplant[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，65（2）：91-107. doi：10.1023/A：1010674425536.

Cui J，Jiang N，Meng J，Yang G L，Liu W W，Zhou X X，Ma N，Hou X X，Luan Y S. 2019. LncRNA33732-respiratory burst oxidase module associated with WRKY1 in tomato-Phytophthora infestans interactions[J]. The Plant Journal，97（5）：933-946. doi：10.1111/tpj.14173.

Dang F F，Wang Y N，She J J，Lei Y F，Liu Z Q，Eulgem T，Lai Y，Lin J，Yu L，Lei D，Guan D Y，Li X，Yuan Q，He S L. 2014. Overexpression of CaWRKY27，a subgroup IIe WRKY transcription factor of Capsicum annuum，posi-tively regulates tobacco resistance to Ralstonia solana-cearum infection[J]. Physiologia Plantarum，150（3）：397-411. doi：10.1111/ppl.12093.

Eulgem T，Rushton P J，Robatzek S，Somssich I E. 2000. The WRKY superfamily of plant transcription factors[J]. Trends in Plant Science，5（5）：199-206. doi：10.1016/S1360-1385（00）01600-9.

Fang X，Meng X，Cao S，Tang X，Fan T. 2021. AtWRKY1 negatively regulates the response of Arabidopsis thaliana to Pst. DC3000[J]. Plant Physiology and Biochemistry，166（1）：799-806. doi：10.1016/J.PLAPHY.2021.06.044.

Fradin E F，Thomma B P H J. 2010. Physiology and molecular aspects of verticillium wilt diseases caused by V. dahliae and V. alboatrum[J]. Molecular Plant Pathology，7（2）：71-86. doi：10.1111/j.1364-3703.2006.00323.x.

Freeborough W，Gentle N，Rey M E C. 2021. WRKY transcription factors in cassava contribute to regulation of to-lerance and susceptibility to cassava mosaic disease through stress responses[J]. Viruses，13（9）：1820. doi：10.3390/V13091820.

Gayoso C，Pomar F，Novo-Uzal E，Merino F，de Ilárduya ó M. 2010. The Ve-mediated resistance response of the tomato to Verticillium dahliae involves H2O2，peroxidase and lignins and drives PAL gene expression[J]. BMC Plant Biology，10（1）：232. doi：10.1186/1471-2229-10-232.

Higuera J J，Garrido-Gala J，Lekhbou A，Arjona-Girona I，Caballero J L. 2019. The strawberry FaWRKY1 transcription factor negatively regulates resistance to Colletotrichum acutatum in fruit upon infection[J]. Frontiers in Plant Science，10：480. doi：10.3389/fpls.2019.00480.

Hofmann M G，Sinha A K，Proels R K，Roitsch T. 2008. Cloning and characterization of a novel LpWRKY1 transcription factor in tomato[J]. Plant Physiology and Biochemistry，46（5）：533-540. doi：10.1016/j.plaphy.2008.02.009.

Inderbitzin P，Bostock R M，Davis R M，Usami T，Platt H W，Subbarao K V. 2011. Phylogenetics and taxonomy of the fungal vascular wilt pathogen verticillium，with the descriptions of five new species[J]. PLoS One，6（12）：e28341. doi：10.1371/journal.pone.0028341.

Li C，He X，Luo X Y，Xu L，Liu L L，Min L，Jin L，Zhu L F，Zhang X L. 2014. Cotton WRKY1 mediates the plant defense-to-development transition during infection of cotton by Verticillium dahliae by activating JASMONATE ZIM-DOMAIN1 expression[J]. Plant Physiology，166（4）：2179-2194. doi：10.1104/pp.114.246694.

Li J B，Luan Y S，Liu Z. 2015. Overexpression of SpWRKY1 promotes resistance to Phytophthora nicotianae and toleran-ce to salt and drought stress in transgenic tobacco[J]. Physiologia Plantarum，155（3）：248-266. doi：10.1111/ppl. 12315.

Long Q，Du M X，Long J H，Xie Y，Zhang J Y，Xu L Z，He Y，Li Q，Chen S C，Zou X P. 2021. Transcription factor WRKY22 regulates canker susceptibility in sweet orange （Citrus sinensis Osbeck） by enhancing cell enlargement and CsLOB1 expression[J]. Horticulture Research，8（1）：50. doi：10.1038/S41438-021-00486-2.

Marchive C，Léon C，Kappel C，Coutos-Thévenot P，Corio-Costet M，Delrot S，Lauvergeat V. 2018. Over-expression of VvWRKY1 in grapevines induces expression of jasmonic acid pathway-related genes and confers higher tolerance to the downy mildew[J]. PLoS One，8（1）：e54185. doi：10.1371/journal.pone.0054185.

Oh S K，Baek K H，Park J M，Yi S Y，Yu S H，Kamoun S，Choi? D. 2008. Capsicum annuum WRKY protein Ca-WRKY1 is a negative regulator of pathogen defense[J]. New Phytologist，177（4）：977-989. doi：10.1111/j.1469-8137.2007. 02310.x.

Pandey S，Somssich I. 2009. The role of WRKY transcription factors in plant immunity[J]. Plant Physiology，150（4）：1648-1655. doi：10.1104/pp.109.138990.

Rushton P J，Somssich I E，Ringler P，Shen Q J. 2010. WRKY transcription factors[J]. Trends in Plant Science，15（5）：247-258. doi：10.1016/j.tplants.2010.02.006.

Sonia E V，Maldonado A M，Francisco A R，de Los Santos Berta，Fernando R，Fernando P，Juan M B，Caballero J L. 2009. Evidence for a positive regulatory role of strawberry （Fragaria×ananassa） FaWRKY1 and Arabidopsis AtWRKY75 proteins in resistance[J]. Journal of Experimental Botany，60（11）：3043-3065. doi：10.1093/jxb/erp152.

Tan G X，Liu K，Kang J M，Xu K D，Zhang Y，Hu L Z，Zhang J，Li C W. 2015. Transcriptome analysis of the compatible interaction of tomato with Verticillium dahliae using RNA-sequencing[J]. Frontiers in Plant Science，6：428. doi：10.3389/fpls.2015.00428.

Ulker B，Somssich I E. 2004. WRKY transcription factors：From DNA binding towards biological function[J]. Current Opinion in Plant Biology，7（5）：491-498. doi：10.1016/j.pbi.2004.07.012.

Wang X，Li J J，Guo J，Qiao Q，Guo X，Ma Y. 2020. The WRKY transcription factor PlWRKY65 enhances the resistance of Paeonia lactiflora （herbaceous peony） to Alternaria tenuissima[J]. Horticulture Research，7（1）：57. doi：10.1038/s41438-020-0267-7.

Xie Z，Zhang Z L，Zou X L，Huang J，Ruas P，Thompson D，Shen Q X. 2005. Annotations and functional analyses of the rice WRKY gene superfamily reveal positive and nega-tive regulators of abscisic acid signaling in aleurone cells[J]. Plant Physiology，137（1）：176-189. doi：10.1104/pp. 104.054312.

收稿日期：2021-09-17

基金項目：國家自然科學基金地區基金項目（31960594）;云南省應用基礎研究面上項目（2019FB059）;云南省農業基礎研究聯合專項面上項目（2018FG001-022）

通訊作者：龔亞菊（1965-），https：//orcid.org/0000-0002-7961-6523，研究員，主要從事蔬菜育種與栽培研究工作，E-mail：gongyaju@sina.com;吳麗艷（1981-），https：//orcid.org/0000-0003-2974-6765，副研究員，主要從事蔬菜育種與栽培研究工作，E-mail：wly@yaas.org.cn

第一作者：尹夢瑩（1996-），https：//orcid.org/0000-0002-5851-6275，主要從事蔬菜分子輔助育種研究工作，E-mail：YinDream19@163.com