不同穿膜肽載體轉染對豬精子受精能力的影響

陳集成 黃秀蕓 鄭自華 韋英明 楊素芳

摘要：【目的】明確修飾基因組通過穿膜肽載體轉染精子的可行性及穿膜肽載體對精子和受精卵的影響，為實現安全有效地大批量制備豬轉基因胚胎提供技術支撐。【方法】以水牛Sohlh2基因為目的基因，通過細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）和慢病毒介導轉染豬精子后，采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察轉染精子形態特征的變化，利用精子圖像分析儀（CASA）檢測精子活率、平均曲線運動速度（VCL）、平均直線運動速度（VSL）和前向性（STR）等指標，運用精子頂體染色試劑盒測定豬精子頂體反應，并通過體外受精進一步驗證不同載體轉染制備生產轉Sohlh基因豬胚胎的效果。【結果】轉染后的豬精子頂體結構完整，細胞膜未見破裂;不同細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）的豬精子轉染陽性率分別為56.74%、50.44%和43.58%，低于慢病毒的轉染陽性率（61.48%），但差異不顯著（P>0.05，下同）。經穿膜肽C105y轉染24 h，豬精子活率（70.09%）、平均直線運動速度（35.36 μm/s）、平均曲線運動速度（42.20 μm/s）、前向性（1.03 μm/s）與對照組相比差異均不顯著;而經穿膜肽MPG和TAT及慢病毒轉染后，豬精子的各項指標均呈一定程度的下降趨勢。細胞穿膜肽轉染豬精子的自發頂體反應率與對照組相比無顯著差異，慢病毒轉染則呈顯著的上升趨勢（P<0.05，下同）;在誘發頂體反應率方面，慢病毒轉染豬精子的誘發頂體反應率較對照組呈顯著下降趨勢，而不同細胞穿膜肽轉染對豬精子誘發頂體反應率也無顯著影響。慢病毒和穿膜肽C105y轉染豬精子經體外受精獲得的受精卵繼續培養24 h后其卵裂率為64.82%和65.91%，與對照組受精卵的卵裂率（64.52%）差異不顯著;穿膜肽C105y轉染組的囊胚率（15.82%）與對照組間無顯著差異，而慢病毒轉染組的囊胚率（9.11%）顯著低于對照組;在轉基因胚胎陽性率方面，穿膜肽C105y轉染組顯著低于慢病毒轉染組（8.54% vs 10.38%）。【結論】穿膜肽C105y對豬精子的受精能力及轉基因豬胚胎發育影響小，且毒害作用不明顯，是一個能高效轉導外源基因的安全載體。

關鍵詞： 穿膜肽載體;豬精子;慢病毒;受精能力;體外受精;轉染

中圖分類號： S828.34? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2022）04-0958-11

Effects of different transmembrane peptide carriers on pig sperm insemination ability

CHEN Ji-cheng1，2， HUANG Xiu-yun3， ZHENG Zi-hua1， WEI Ying-ming1*， YANG Su-fang1*

（1State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources/Guangxi University， Nanning，Guangxi? 530004， China; 2Guangxi Agricultural Vocational University， Nanning， Guangxi? 530007， China; 3Guangxi Polytechnic of Construction， Nanning， Guangxi? 530007， China）

Abstract：【Objective】To clarify the feasibility of transfection of modified genome into spermatozoa by transmembrane peptide and the effect of transmembrane peptide on spermatozoa and fertilized eggs， so as to provide technical support for the safe and effective mass production of pig transgenic embryos. 【Method】 With buffalo Sohlh2 gene as the target gene， pig spermatozoa were transfected by cell membrane penetrating peptide （C105y， MPG and TAT） and lentivirus. Morphological characteristics of transfected spermatozoa were observed by laser confocal scanning microscope. Sperm viability， mean curvilinear velocity （VCL）， mean linear velocity （VSL） and forward tropism （STR） were detected by sperm image analyzer （CASA）， Sperm acrosome staining kit （psa-fitc） was used to detect pig sperm acrosome reaction， and in vitro fertilization was used to further verify the effect of different vector transfection on the production of Sohlh transgenic pig embryos. 【Result】The acrosome structure of transfected pig sperm was intact， and the cell membrane was not broken. The positive rates of pig sperm transfection with different cell penetrating peptides （C105y， MPG and TAT） were 56.74%， 50.44% and 43.58% respectively， which were lower than that of lentivirus （61.48%）， but the difference was not significant （P>0.05， the same below）. After transfection with membrane penetrating peptide C105y for 24 hours， the pig sperm viability （70.09%） and the average linear velocity （35.36 μm/s）， average curve velocity （42.20 μm/s）， forward directivity （1.03 μm/s）， compared with the control group， the difference was not significant. After transfection with membrane penetrating peptides MPG， TAT and lentivirus， the indexes of pig sperm showed a downward trend to some extent. There was no significant difference in the incidence of spontaneous acrosome reaction in pig spermatozoa transfected with cell penetrating peptide compared with the control group， but there was a significant upward trend in lentivirus transfection （P<0.05， the same below）. In the aspect of inducing acrosome reaction rate， the rate of inducing acrosome reaction in pig sperm transfected with lentivirus was significantly lower than that in the control group， while the rate of inducing acrosome reaction in pig sperm transfected with different cell penetrating peptides had no significant effect. The cleavage rates of the fertilized eggs obtained from porcine sperm transfected with lentivirus and transmembrane peptide C105y after in vitro fertilization were 64.82% and 65.91% after 24 hours of culture， which were not significantly different from those of the control group （64.52%）. There was no significant difference in the blastocyst rate （15.8%） between the transfected group and the control group， but the blastocyst rate （9.11%） in the lentivirus transfected group was significantly lower than that in the control group. In terms of the positive rate of transgenic embryos， the membrane penetrating peptide C105y transfection group was significantly lower than that of the lentivirus transfection group （8.54% vs 10.38%）. 【Conclusion 】Membrane penetrating peptide C105y has little effect on the fertilization ability of pig sperm and the development of transgenic pig embryos， and its toxic effect is not obvious. It is a safe vector for efficient transduction of foreign genes.

Key words： transmembrane peptide; pig sperm; lentivirus; fertilization ability; in vitro fertilization; transfection

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （31860644）; National Modern Agricultural Industrial Technology System Guangxi Innovation Team Construction Project （nycytxgxcxtd-2021-09-01）; Guangxi Natural Science Foundation Project （2019GXNSFDA185002）

0 引言

【研究意義】豬和人類在解剖學、生理學上具有極大的相似性，是人類異種器官移植的理想來源（蘭宗寶等，2008;潘斌等，2011;孫武和娜日蘇，2015），但強烈的排斥反應阻礙著該設想的臨床實施，而通過轉基因技術改造豬的遺傳性狀以適應人類性狀有望解決超排斥的問題。據報道，2022年1月7日美國馬里蘭大學醫學院團隊成功對一名晚期心臟病男性患者實施全球首例轉基因豬心臟移植（Servick，2022），進一步證實經基因編輯后的豬器官可作為異種器官移植來源。轉基因豬的獲得方法有逆轉錄病毒感染法、DNA顯微注射法、基因打靶技術及精子載體法等（高晗和鐘蓓，2020），其中，精子載體法的原理是利用精子具有自主結合并內化轉運外源DNA的能力，可作為載體攜帶外源DNA進入卵母細胞，具有簡單便捷、應用廣泛和成本低等特點，是生產轉基因動物的有效途徑之一，利用該技術已成功獲得小鼠、家兔、豬、牛、雞、綿羊等轉基因動物（Sperandio et al.，1996;Lavitrano et al.，2003;Shen et al.，2006;Harel-Markowitz et al.，2009）。但精子載體法也存在重復率較低及外源DNA未能整合進入基因組而游離在外的問題（Chaparian et al.，2016），精子細胞膜阻止外源基因進入是主要原因，且利用慢病毒等載體易對精子的受精能力產生一定影響（蔡偉光等，2013）。穿膜肽載體具有安全低毒的特點，可有效穿透精子細胞膜（陳厚仰等，2014;Rádis-Baptista et al.，2017），但其對精子受精能力的影響尚未明確。因此，探究穿膜肽載體對精子受精能力的影響，對成功安全開展豬精子載體法大量培育轉基因豬及有效解決臨床醫學中異種器官移植的超排斥問題具有重要意義。【前人研究進展】早在20世紀70年代，Brackett等（1971）就將家兔精子與H3標記的SV40基因共培養后進行體外受精，結果發現家兔精子在受精過程中能將外源DNA帶入卵母細胞，由此開啟了精子介導外源DNA轉移的研究工作。但精子載體法一直存在陽性率不高的問題，主要是缺乏有效載體將外源基因送入精子內（Gandolfi，2000）。慢病毒載體是一種外源性的轉基因載體，是以人類免疫缺陷I型病毒（HIV-1）為基礎構建的載體系統（湯晗等，2017），可有效將外源基因整合到宿主染色體上，但慢病毒有一定細胞毒性及遺傳毒性，有報道稱慢病毒易導致細胞腫瘤化（Montini et al.，2006）。細胞穿膜肽（Cell-penetrating peptides，CPPs）是一種以內吞方式直接穿過細胞膜的多肽，自1988年被發現以來，已有數百種細胞穿膜肽被發現報道（Wang et al.，2014），根據其結構特點可分為陽離子型、兩親性型和疏水型（Guidotti et al.，2017）。Li等（2018）研究表明，與慢病毒等載體相比，細胞穿膜肽只有在2 μmol/L的高劑量下才表現出細胞毒性。在穿膜活性方面，TAT、MPG-8及Bac-7等穿膜肽能顯著將生物活性親水性分子，如藥物、核酸（DNA和RNA）甚至高分子量蛋白，轉運至細胞質和細胞器內（梅雋彥，2020）。閆可心等（2021）研究表明穿膜肽R9和TAT均可輕易通過血腦屏障，即以穿膜肽作為藥物的高效載體能將藥物轉運到大腦，使其對大腦有更強更好的藥效。除了傳導藥物外，穿膜肽還能轉導外源基因，促使基因和蛋白表達的改變、誘導多能干細胞重編程和分化，以及推進細胞疫苗制備。王軍（2013）利用重疊PCR將細胞穿膜肽TAT與c-Myc和Nanog基因片段融合，成功將外源基因Oct4、c-Myc等導入成體細胞使其重編程，最終獲得具有類似于干細胞性質的誘導多功能干細胞。陳厚仰等（2014）通過構建細胞穿膜肽TAT與EGFP融合蛋白的原核表達系統，并鑒定其對人類成熟精子的活性，結果表明穿膜肽對精子也有穿膜作用，將外源基因帶入人類精子的穿膜效率達65.27%。此外，已有研究證實將精子載體法（Sperm-mediated gene transfer，SMGT）與體外受精（In vitro fertilization，IVF）相結合能高效制備轉基因小鼠（Lavitrano et al.，1989），但體外受精需要完全正常的精子才能進行。【本研究切入點】目前，有關細胞穿膜肽作用于精子的研究主要集中在穿膜肽對精子的穿膜活性方面（Jones，2013;陳厚仰等，2014），而針對細胞穿膜肽影響動物精子受精能力及通過體外受精生產轉基因胚胎陽性率的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以水牛Sohlh2基因為目的基因，通過穿膜肽介導轉染豬精子后觀察轉染精子形態特征的變化，使用精子全自動分析系統檢測不同載體對轉染豬精子各生化指標的影響，并通過體外受精制備轉Sohlh2基因豬胚胎，明確修飾基因組通過穿膜肽載體轉染精子的可行性及穿膜肽載體對精子和受精卵的影響，為實現安全有效地大批量制備轉基因豬胚胎提供技術支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

新鮮豬精液由廣西畜禽品種改良站采集提供，水牛Sohlh2基因由亞熱帶生物資源保護利用國家重點試驗室克隆獲得。豬精液常溫稀釋劑基礎液參照陳東峰（2013）的方法進行配制，具體成分如表1所示。胚胎培養液（PCM）：NCSU.23基礎液+0.5%牛血清白蛋白（BSA）。卵巢保存及運輸液：含K+、Ca2+及Mg2+的生理鹽水。受精液（PFM）：mTBM液+113.1 mmol/L NaCl+3.0 mmol/L KCl+7.5 mmol/L CaCl2·2H2O+20.0 mmol/L Tris+11.0 mmol/L葡萄糖+5.0 mmol/L丙酮酸鈉（含0.5 mmol/L咖啡因和0.2% BSA）。0.1%透明質酸酶：稱取100 mg透明質酸酶，以胚胎培養液溶解，最終定容至100 mL。以上配制好的試劑均采用孔徑0.22 μm的微孔濾膜過濾消毒，分裝后置于4 ℃冰箱保存備用。

1. 2 精液稀釋與保存

精液稀釋液先在水浴鍋中預熱，使其溫度保持在35.0 ℃左右。采集的豬精液要求在45 min內保溫運回實驗室，放入水浴鍋中靜止5 min，以確保與稀釋液溫度一致。取混勻后的原精液5 μL制片（載玻片和蓋玻片先預熱至38.0 ℃），通過精子圖像分析儀（CASA）對豬精子的活力和密度等進行觀察并記錄（精子活力要求在0.7以上，密度要求在1.5億個/mL以上），然后按照3倍稀釋的原則對原精液進行稀釋，稀釋時將稀釋液沿著管壁緩慢加入豬精液中，邊加入邊輕微晃動，使精液與稀釋液充分接觸（李平等，2020）。豬精液稀釋后的密度保持在3.0×107～5.0×107個/mL。在室溫環境（20.0～25.0 ℃）下避光放置1 h后進行溫度平衡，然后用毛巾包裹數十層，放入17.0 ℃恒溫箱中保存（陳東峰，2013）。

1. 3 慢病毒載體構建及包裝

采用EcoR I和Xba I分別雙酶切pLvx-ires-zsgreen載體和pMD18-T-Sohlh2，回收酶切產物，通過T4連接法將Sohlh2基因連接至pLvx-ires-zsgreen載體上，即構建獲得慢病毒載體（pLvx-ires-zsgreen-Sohlh2）。pLvx-ires-zsgreen-Sohlh2逆轉錄病毒包裝：在病毒包裝前16～20 h將Plat-GP包裝細胞接種至60 mm的細胞培養皿中，并于轉染前2～4 h換取3 mL的無血清DMEM。在1 mL的無血清DMEM中加入9 μg 慢病毒載體和9 μL Plus，混勻，室溫孵育5 min;再加入12 μL LTX，混勻，室溫孵育30 min后均勻滴加至細胞培養皿中;4～6 h后換取正常的培養基;轉染48 h后熒光顯微鏡觀察，并收集病毒上清液，0.45 μm濾器過濾備用。

1. 4 精子轉染及激光共聚焦掃描顯微鏡觀察

細胞穿膜肽室溫放置30 min，于28.0 ℃水浴鍋中平衡液體。向1.5 mL的離心管中加入50 μL無血清DMEM及4 μL細胞穿膜肽，同時向另一支1.5 mL的離心管中加入50 μL無血清DMEM及2 μg制備好的Sohlh2基因質粒;混勻2支離心管中的液體，放入37.0 ℃恒溫箱中靜置20 min。以4 μL去離子水混合50 μL無血清DMEM為對照組。將100 μL轉染液體滴加至經3倍稀釋豬精液（300 μL）中;混合后的豬精液在室溫下避光放置1 h后進行溫度平衡，在熒光顯微鏡450～490 nm激發光下油鏡觀察涂片。同時利用血細胞計數器計數400個以上豬精子，統計其中的發光精子數量。備用的豬精液以0.85% NaCl洗滌2次后，3500 r/min離心10 min，棄上清液，再沿離心管內壁緩慢加入2.5%戊二醛固定液，4.0 ℃冰箱內固定2～4 h，蒸餾水清洗，以激光共聚焦掃描顯微鏡進行觀察，重點觀察精子發光部位。

1. 5 精子質量檢測

檢測時先將從恒溫箱中取出的精液樣品放入35.0～37.0 ℃水浴鍋中預熱20～30 min，用移液槍輕輕吹打精液樣品使其混合均勻，隨機吸取3～5 μL精液樣本滴在載玻片（預熱38.0 ℃）上，蓋上蓋玻片（預熱38.0 ℃）后置于恒熱加熱板上，待精液樣品靜止穩定再通過精子圖像分析儀（CASA）檢測精子活率（Motility）、平均曲線運動速度（VCL）、平均直線運動速度（VSL）及前向性（STR）。

1. 6 卵母細胞采集與培養

豬卵巢采自屠宰場的青年母豬，將卵巢放入裝有35.0 ℃生理鹽水的保溫瓶內，運送回實驗室的時間控制在1 h內。采用眼科剪去除卵巢周圍的脂肪及結締組織，于超凈恒溫操作臺上用一次性的10 mL注射器抽取直徑2～6 mm卵泡內的卵泡液（含卵母細胞），實體視顯微鏡下挑選出卵母細胞，將具有完整形態的卵丘卵母細胞復合體移入盛有l mL成熟培養液（PMH）的培養皿中，每皿200枚，置于38.5 ℃、5% CO2及最大飽和濕度的培養箱中體外成熟培養24 h，再轉移至成熟液（PM）培養22 h。成熟培養結束后，用200 mL移液槍反復吹打去除卵母細胞周圍的卵丘細胞，放入添加有0.1%透明質酸酶的胚胎培養液中繼續吹打1 min，以除去剩余的卵丘細胞，經培養液洗滌后挑選出具有第一極體的成熟卵母細胞，備用。

1. 7 精子準備處理

將新鮮采集且3倍稀釋的豬精液迅速帶回實驗室，取200 mL稀釋精液小心置于含2 mL受精液（預熱38.5 ℃）的圓底試管底部，懸浮30 min后將上層液吸出，1900 r/min離心3 min，棄上清液，再添加洗清液至2 mL，800 r/min離心3 min，棄上清液，最后將試管底部的沉淀用1 mL受精液重懸，室溫（26.0 ℃）下存放備用。

1. 8 精子頂體染色試劑盒測定豬精子頂體反應

依照ARIC檢測試劑盒說明，采用密度梯度離心法聯合上游法處理液化好的精液，調整濃度至1×106個/mL后等分成2管，置于5% CO2、37.0 ℃下孵育3 h，以誘導精子獲能。其中一管加入鈣離子載體A23187誘發15 min（誘發管），另一管不加鈣離子載體A23187但同步孵育15 min（自發管），頂體反應結束后，500 r/min離心5 min，PBS清洗1次，然后以50 μL PBS重懸獲得精子懸液。涂片（每片10 μL）后在空氣中完全干燥，4% PFA室溫固定10 min，PBS洗5 min，重復2次。以豌豆凝集素熒光標記（PSA-FITC）4.0 ℃孵育過夜，熒光顯微鏡450～490 nm激發光下油鏡觀察涂片以檢測精子頂體反應。利用血細胞計數器計數400個以上豬精子，統計誘發頂體發生數量及自發頂體發生數量。自發頂體反應率（%）=自發頂體發生數/檢測精子總數×100;誘發頂體反應率（%）=誘發頂體發生數/檢測精子總數×100。

1. 9 精子載體法+體外受精（SMGT+IVF）

將預處理的豬精液（約20 μL）與30個具有第一極體的成熟豬卵母細胞置于受精液滴（50 μL）中，精卵比例約1000∶1，置于5% CO2、38.5 ℃和最大飽和濕度的培養箱中共孵育6 h，然后取出以洗卵液充分洗滌，再放入50 μL的胚胎培養液滴中，繼續培養觀察其發育情況，并做好記錄。

1. 10 統計分析

試驗數據分別采用SPSS 22.0進行單因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncan?s多重比較。

2 結果與分析

2. 1 轉染前后豬精子形態特征的變化情況

3種細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）轉染豬精子24 h的效果如圖1所示。經細胞穿膜肽轉染后各處理組的豬精子頂體結構完整，細胞膜未見破裂;C105y組、MPG組、TAT組和慢病毒組均有精子發出綠色熒光，在不同細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）處理組中以穿膜肽C105y轉染后獲得的發綠色熒光精子數量最多。經統計，C105y組、MPG組、TAT組的豬精子轉染陽性率分別為56.74%、50.44%和43.58%，均低于慢病毒組（61.48%），但差異不顯著（P>0.05，下同）。圖2所示為穿膜肽C105y轉染豬精子后其頂體部位發出綠色熒光，說明外源水牛Sohlh2基因已成功轉染豬精子。

2. 2 不同穿膜肽載體轉染對豬精子活率的影響

采用精子圖像分析儀（CASA）檢測轉染后的豬精子活率，結果如表2所示。3種細胞穿膜肽（C105y、Mpg和TAT）轉染24 h的豬精子活率分別為70.09%、66.40%和64.73%，與對照組的豬精子活率（74.02%）差異不顯著，以穿膜肽C105y轉染對豬精子活率的影響最小;經慢病毒轉染24 h后豬精子活率降至60.69%，顯著低于對照組和C105y組（P<0.05，下同）。不同載體轉染48 h后，豬精子活率呈明顯下降趨勢，與對照組的差異均達顯著差異水平。

2. 3 不同穿膜肽載體轉染對豬精子平均直線運動速度的影響

采用精子圖像分析儀（CASA）檢測轉染后的豬精子平均直線運動速度，結果如表3所示。穿膜肽C105y轉染24 h，豬精子平均直線運動速度為35.36 μm/s，與對照組相（36.80 μm/s）的差異不顯著，但顯著高于MPG組（31.15 μm/s）和慢病毒組（21.74 μm/s）。不同載體轉染48 h后，轉染豬精子平均直線運動速度均顯著低于對照組。

2. 4 不同穿膜肽載體轉染對豬精子平均曲線運動速度的影響

采用精子圖像分析儀（CASA）檢測轉染后的豬精子平均曲線運動速度，結果如表4所示。經穿膜肽C105y轉染24 h，豬精子平均曲線運動速度（42.20 μm/s）與對照組（45.78 μm/s）相比差異不顯著，而經其他細胞穿膜肽（MPG和TAT）和慢病毒轉染后的豬精子平均曲線運動速度與對照組間存在顯著差異。不同載體轉染48 h后，以慢病毒轉染對豬精子平均曲線運動速率的影響最大，與對照組間存在顯著差異，而不同細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）轉染的豬精子平均曲線運動速率（30.64、29.17和29.28 μm/s）與對照組相比差異均不顯著。

2. 5 不同穿膜肽載體轉染對豬精子前向性的影響

由表5可得知，經穿膜肽TAT和慢病毒轉染24 h，豬精子前向性分別為0.97和0.92 μm/s，與對照組（1.12 μm/s）間存在顯著差異，但與穿膜肽C105y和MPG轉染的豬精子相比差異不顯著。至轉染48 h后，慢病毒轉染的豬精子前向性（0.80 μm/s）顯著低于比對照組（1.11 μm/s），但與不同細胞穿膜肽（C105y、MPG和TAT）轉染的豬精子前向性（0.95、0.93和0.91 μm/s）相比差異均不顯著。

2. 6 轉染后豬精子頂體反應率變化的測定結果

由表6可知，細胞穿膜肽（C105y、MPG和Tat）轉染1 h后，豬精子的自發頂體反應率分別為5.71%、5.42%和5.71%，與對照組豬精子的自發頂體反應率（5.80%）無顯著差異，而經慢病毒轉染后豬精子的自發頂體反應率（7.21%）呈顯著上升趨勢。在誘發頂體反應率方面，慢病毒轉染豬精子的誘發頂體反應率（25.22%）較對照組（36.22%）呈顯著下降趨勢，而不同細胞穿膜肽轉染對豬精子誘發頂體反應率無顯著影響。

2. 7 慢病毒和穿膜肽C105y轉染對轉Sohlh2基因豬胚胎發育的影響

通過體外受精進一步驗證不同載體轉染制備生產轉Sohlh基因豬胚胎的效果，結果發現經慢病毒和穿膜肽C105y轉染的豬精子與體外培養成熟豬卵母細胞進行體外受精均能獲得受精卵，在熒光顯微鏡下能觀察到均勻的綠色熒光，且慢病毒轉染的受精卵發出綠色熒光較強烈（圖3），而對照組的受精卵未觀察到綠色熒光。轉Sohlh基因豬胚胎發育結果（表7）顯示，慢病毒和穿膜肽C105y轉染的受精卵體外繼續培養24 h后，其卵裂率為64.82%和65.91%，與對照組受精卵的卵裂率（64.52%）差異不顯著;穿膜肽C105y轉染組的囊胚率（15.82%）與對照組（13.80%）間無顯著差異，而慢病毒轉染組的囊胚率（9.11%）顯著低于對照組;在轉基因胚胎陽性率方面，穿膜肽C105y轉染組顯著低于慢病毒轉染組（8.54% vs 10.38%）。

3 討論

3. 1 穿膜肽載體轉染方式對豬精子功能的影響

精子載體法是制備轉基因豬的重要手段，而介導外源基因進入精子的穿膜肽安全性及其對精子功能的影響，是利用精子載體法+體外受精成功制備轉基因豬的關鍵，目前國內外針對精子正常功能的研究主要涉及精子能動性參數、精子頂體反應及體外受精能力。采用精液稀釋劑可有效延長豬精液保存期限。陳東峰（2013）研究表明，使用稀釋劑3倍稀釋豬精液，7 d后的活精子數（70.84±1.81）與剛稀釋時（88.20±1.48）無顯著差異，精子質膜完整率及頂體完整率也無顯著變化，說明稀釋劑能有效延長豬精液保存期限，且對精子的受精能力無顯著影響。頂體反應是完成受精的必要條件，不僅促使精子穿透卵母細胞，還能釋放頂體內容物中的大量水解酶而激活精子與卵母細胞相互融合，只有發生頂體反應的精子才能完成體外受精（何晨，2020）。已有研究表明，精子在與透明帶結合前發生頂體反應會影響其受精能力，因此檢測精子是否存在自發頂體反應是判斷其受精能力的重要手段（劉樹沅等，2018），當精子自發頂體反應率≥9.52%時，其受精能力受到明顯影響，需要人工助孕措施（陳其桂等，2020）。在本研究中，慢病毒轉染致使豬精子的自發頂體反應率顯著升高，而經細胞穿膜肽（C105y、Mpg和Tat）轉染的豬精子自發頂體反應率與對照組無顯著差異。此外，使用鈣離子載體A23187體外誘導Ca2+進入精子內部獲能后即發生頂體反應，是世界衛生組織（World health organization，WHO）推薦的精子受精能力評估指標（許世艷等，2021）。Katsuki等（2005）預測表明，體外受精時完全不受精的頂體反應率閾值是21.00%，建議當頂體反應率<21.00%時宜選擇人工助孕。本研究結果表明，細胞穿膜肽（C105y、Mpg和TAT）和慢病毒轉染的豬精子誘發頂體反應率均在21.00%以上，慢病毒轉染的豬精子誘發頂體反應率顯著低于對照組，而細胞穿膜肽轉染對豬精子誘發頂體反應率無顯著影響，說明細胞穿膜肽對豬精子頂體反應的影響不明顯。

除了頂體反應外，精子能動性參數也影響其受精能力，包括精子活率、平均直線運動速度、平均曲線運動速度及前向性（陳永霞等，2018）。根據GB/T 25172—2010《豬常溫精液生產與保存技術規范》和GB 23238—2009《種豬常溫精液》的定義，精子活率是指在37.0 ℃下呈直線前進運動精子數占精子總數的百分率。因此，利用全自動精子分析儀測定豬精液中呈直線前進運動的精子數量即可獲知豬常溫下的精子活率。精子活率是反映精子質量和衡量轉染精子能否受精的一項重要指標。除了常規指標外，動態指標也能間接反映精子的受精能力。胡國娟（2020）研究表明，豬精子能動性參數和正常形態精子的比例與其體外受精率及妊娠率顯著相關;范妮等（2021）研究發現精子密度、精子活率、前向運動率及正常形態率與人類精子的受精能力呈正相關。精子活率是精液品質的重要指標，豬的人工授精成功率主要受精子活率的影響，一般要求精子活率在60.00%以上。馮文武等（2021）對長白豬、杜洛克及柯樂豬等3個品種的精子活率和能動性參數進行測定，發現精子的動態指標對其存活時間影響顯著，且柯樂豬的精子活率高于其他良種豬。為此，本研究通過測定精子活率、平均曲線運動速度、平均直線運動速度及前向性等指標，以確定各種載體轉染對豬精子受精能力的影響，結果表明，C105y、TAT和Mpg等3種細胞穿膜肽轉染對豬精子活率的影響相對較小，具體表現為穿膜肽C105y和TAT轉染對豬精子直線運動速度影響較小，穿膜肽C105y轉染對豬精子平均曲線運動速度影響最小，穿膜肽C105y和Mpg轉染對豬精子前向性影響不明顯。以慢病毒轉染的豬精子各項指標均呈顯著下降趨勢，說明慢病毒對豬精子有毒性。綜上所述，C105y是最適于豬體外受精的穿膜肽載體，對各項指數影響較小。C105y屬于疏水性穿膜肽，而疏水性是其高效率運輸修飾基因組通過細胞膜到達精子內部的關鍵（P?rnaste et al.，2017）。Jones等（2013）利用3種穿膜肽（C105y、Cyt c5–13和Camptide）轉染處理人類精子3 h，結果發現這3種穿膜肽對精子活率的影響都很小。本研究也發現，經穿膜肽C105y轉染24 h，豬精子活率仍高達70.09%，與對照組的豬精子活率差異不顯著，即穿膜肽C105y轉染對豬精子活率的影響最小。

3. 2 穿膜肽C105y對轉Sohlh基因豬胚胎發育的影響

精子的受精能力除了體現在各項指標正常外，更表現在受精卵的正常發育方面，只有制備產生的轉基因胚胎陽性率高且不受影響，才能真正體現出穿膜肽既有穿透效率又對精子低毒的價值。精子獲取外源基因的能力可因新介質的使用而顯著增加（Gong et al.，2018）。最新研究表明，許多穿膜肽已成功將寡核苷酸、蛋白質和載藥納米顆粒等物質運送至哺乳動物細胞群體，精子作為重要的動物細胞群體之一，還具有產生下一代基因載體的作用（Hadar et al.，2018）。精子的運動狀態受大劑量DNA抑制影響，究其原因可能是精子內容物受大劑量脂質體的毒性影響。Rostami等（2018）使用新型穿膜肽M918成功將熱休克蛋白（Hsp）基因轉運至HEK-293T哺乳動物細胞系中，并證實穿膜肽M918的轉染效率顯著高于單一使用Nef或Hsp20-Nef的轉染效率，即穿膜肽M918能有效增加Hsp20-Nef的穿透效果。慢病毒等介質雖然也能有效介導外源基因進入靶細胞內，但對靶細胞具有一定的毒害作用（蔡偉光等，2013）。穿膜肽不僅可有效促使生殖細胞攝取外源基因，且對精子無毒害作用，不影響其受精能力。

本研究以濃縮滴度達108的慢病毒為陽性對照載體，結果顯示，慢病毒轉染豬精子體外受精獲得的轉基因胚胎陽性率（10.38%）略高于穿膜肽C105y轉染的豬精子（8.54%），但二者差異不顯著。由于慢病毒對精子具有一定的毒害作用，因此其受精卵的囊胚率（9.11%）顯著低于穿膜肽C105y（15.82%）。冉林武等（2017）研究表明，通過睪丸注射慢病毒載體能制備獲得轉基因小鼠，其仔代轉基因小鼠陽性率最高為35%，即慢病毒孵育精子可得到陽性后代。盡管慢病毒轉染效率高，但利用精子載體法進行人工授精時顯著影響其受胎率，孫克寧（2011）以慢病毒先孵育精子后進行體外受精，并未得到陽性結果，但采用低滴度的慢病毒（106 TU/mL）轉染小鼠受精卵，結果發現受精卵的陽性率為8.3%。此外，慢病毒具有一定的遺傳毒性，易導致轉基因動物觸發癌癥（陳彩云等，2012）。本研究采用精子載體法聯合體外受精，結果獲得8.54%的轉基因胚胎陽性率，略高于孫克寧（2011）直接以慢病毒感染受精卵的陽性率，但今后仍需進一步提高轉基因胚胎陽性率以滿足制備生產轉基因豬的需求。

4 結論

穿膜肽C105y對豬精子的受精能力及轉基因豬胚胎發育影響小，且毒害作用不明顯，是一個能高效轉導外源基因的安全載體。

參考文獻：

蔡偉光，習欠云，肖敏，關立增，孟繁明，束剛，朱曉彤，江青艷，吳珍芳，張永亮. 2013. 精子與慢病毒共孵育條件的優化以及轉基因豬的制備[J]. 中國農業科學，46（9）：1903-1914. [Cai W G，Xi Q Y，Xiao M，Guan L Z，Meng F M，Shu G，Zhu X T，Jiang Q Y，Wu Z F，Zhang Y L. 2013. Optimization of incubation of sperm and lentivirus and transgenic pigs production[J]. Scientia Agricultura Sinica，46（9）：1903-1914.] doi：10.3864/j.issn. 0578-1752.2013.09.018.

陳彩云，劉亞京，牛忠英. 2012. 慢病毒載體的研究進展及應用[J]. 口腔頜面修復學雜志，13（2）：117-120. [Chen C Y，Liu Y J，Niu Z Y. 2012. Research progress and application of lentivirus vector[J]. Chinese Journal of Prostho-dontics，13（2）：117-120.] doi：10.3969/j.issn.1009-3761. 2012.02.017.

陳東峰. 2013. 公豬精液在不同溫度下保存和稀釋劑添加不同添加劑保存公豬精液后的一些生理生化變化[D]. 南寧：廣西大學. [Chen D F. 2013. The physiological and biochemical variations of boar sperm which diluted by extenders with different additives and stored under diffe-rent temperature[D]. Nanning：Guangxi University.] doi：10.7666/d.Y2407959.

陳厚仰，仇克清，孫捷，黃志輝，應志偉，吳麗萍，曾韓，伍瓊芳. 2014. 穿膜肽EGFP的構建及其對人成熟精子的穿膜活性鑒定[J]. 中國男科學雜志，28（11）：8-13. [Chen H Y，Qiu K Q，Sun J，Huang Z H，Ying Z W，Wu L P，Zeng H，Wu Q F. 2014. Construction of CPPs EGFP and veriifcation of its transmembrane activity on human mature sperm[J]. Chinese Journal of Andrology，28（11）：8-13.] doi：10.3969/j.issn.1008-0848.2014.11.002.

陳其桂，李大文，譚衛紅，成俊萍，薛林濤，李金燕，何泳志，龐太森，韋福，黃泰帥. 2020. 精子正常形態率、頂體完整率及頂體反應率與補救ICSI結局相關性研究[J]. 生殖醫學雜志，29（12）：1581-1586. [Chen Q G，Li D W，Tan W H，Cheng J P，Xue L T，Li J Y，He Y Z，Pang T S，Wei F，Huang T S. 2020. Relationship between normal sperm morphology rate，sperm acrosome integrity rate，acrosome reaction rate and outcome of rescue ICSI[J]. Journal of Reproductive Medicine，29（12）：1581-1586.] doi：10.3969/j.issn.1004-3845.2020.12.008.

陳永霞，張群，馬靜，楊劍波，邢軍，吳井生. 2018. 不同品種公豬精子活力的定量檢測和比較[J]. 黑龍江畜牧獸醫，（10）：71-74. [Chen Y X，Zhang Q，Ma J，Yang J B，Xing J，Wu J S. 2018. Quantitative detection and comparison of sperm motility of different boars[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（10）：71-74.] doi：10.13881/j.cnki.hljxmsy.2017.08.0370.

范妮，張海波，王康揚，符雄. 2021. 抗精子抗體與精子密度、精子活率、精子正常形態及人工授精助孕結局關系[J]. 中國計劃生育學雜志，29（10）：2109-2111. [Fan N，Zhang H B，Wang K Y，Fu X. 2021. Relationship between anti-sperm antibody positive rate， concentration of sperm， forward motility of sperm， and atypical forms of sperm of the man and their pregnancy outcomes after artificial insemination[J]. Chinese Journal of Family Planning，29（10）：2109-2111.] doi：10.3969/j.issn.1004-8189. 2021.10.022.

馮文武，李平，陳大芳，李俊，楊蓉，蔣桂榮，王欽，蘇娜芬. 2021. 柯樂豬與國外品種豬精子活力的比較分析[J]. 養豬，（3）：47-49. [Feng W W，Li P，Chen D F，Li J，Yang R，Jiang G R，Wang Q，Su N F. 2021. Study on the comparison of Kele boar sperm vitality with two foreign species[J]. Swine Production，（3）：47-49.] doi：10.3969/j.issn. 1002-1957.2021.03.019.

高晗，鐘蓓. 2020. 轉基因技術和轉基因動物的發展與應用[J]. 現代畜牧科技，（6）：1-4. [Gao H，Zhong B. 2020. The development and application of transgenic techno-logy and transgenic animals[J]. Modern Animal Husban-dry Science & Technology，（6）：1-4.] doi：10.19369/j.cnki. 2095-9737.2020.06.001.

何晨. 2020. AC220和ZK 93426對精子獲能和頂體反應的影響研究[D]. 上海：上海交通大學. [He C. 2020. Effects of AC220 and ZK 93426 on sperm capacitation and acrosome reaction[D]. Shanghai ：Shanghai Jiaotong University.] doi：10.27307/d.cnki.gsjtu.2020.003649.

胡國娟. 2020. 不同影響因素下大白豬精子活力和保存時間的研究[J]. 甘肅畜牧獸醫，50（1）：66-69. [Hu G J. 2020. Study on sperm viability and preservation time of large white pigs under different influencing factors[J]. Gansu Animal and Veterinary Sciences，50（1）：66-69.] doi：10. 3969/j.issn.1006-799X.2020.01.025.

蘭宗寶，王修文，許惠艷. 2008. 豬器官異種移植研究進展[J]. 廣西農業科學，39（3）：380-384. [Lan Z B，Wang X W，Xu H Y. 2008. Progress of porcine organs xenotransplantation[J]. Guangxi Agricultural Sciences，39（3）：380-384.] doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2008.03.030

李平，唐明宗，申金容，陳大芳，龍清孟，曾金，張云淞，時穎，吳光松，李維. 2020. 不同檢測時間下種豬常溫精液精子活力的研究[J]. 養豬，（5）：33-35. [Li P，Tang M Z，Shen J R，Chen D F，Long Q M，Zeng J，Zhang Y S，Shi Y，Wu G S，Li W. 2020. Study on sperm motility of normal temperature semen of breeding pigs at different detection times[J]. Swine Production，（5）：33-35.] doi：10.3969/j.issn.1002-1957.2020.05.011.

劉樹沅，韋劍洪，陳偉輝，霍駿業. 2018. 精子自發頂體反應率與體外受精胚胎質量的相關性研究[J]. 檢驗醫學與臨床，15（1）：16-18. [Liu S Y，Wei J H，Chen W H，Huo J Y. 2018. Correlation between sperm spontaneous acrosome reaction and in vitro fertilization embryo quality[J]. Laboratory Medicine and Clinic，15（1）：16-18.] doi：10.3969/j.issn.1672-9455.2018.01.005.

梅雋彥. 2020. 基于細胞穿膜肽的藥物遞送研究進展[J]. 廣州化學，45（2）：64-75. [Mei J Y. 2020. Advances in drug delivery based on cell-penetrating peptides[J]. Guangzhou Chemistry，45（2）：64-75.] doi：10.16560/j.cnki.gzhx.2020 0213.

潘斌，楊輝，郭亞芬，范晶，蘭干球，蔣欽楊，朱祁明，王愛德. 2011. 4個品種豬血清中sLAIR-1表達量的ELISA檢測[J]. 南方農業學報，42（1）：102-104. [Pan B，Yang H，Guo Y F，Fan J，Lan G Q，Jiang Q Y，Zhu Q M，Wang A D. 2011. ELISA detection of sLAIR-1 expression in the serum of four swine species[J]. Journal of Southern Agriculture，42（1）：102-104.] doi：10.3969/j.issn.2095-1191. 2011.01.024.

冉林武，張文文，榮瑞奇，姚濤貴，楊文，陳健茂，李紅兵. 2017. 睪丸注射慢病毒載體制備轉基因小鼠研究[J]. 寧夏醫科大學學報，39（1）：34-37. [Ran L W，Zhang W W，Rong R Q，Yao T G，Yang W，Chen J M，Li H B. 2017. Study on generation of transgenic mice by intratesticular injection of lentiviral vector[J]. Journal of Ningxia Medical University，39（1）：34-37.] doi：10.16050/j.cnki.issn 1674-6309.2017.01.009.

孫克寧. 2011. 利用慢病毒載體制備轉基因小鼠和牛胚胎的研究[D]. 鄭州：河南農業大學. [Sun K N. 2011. Study on the generation of transgenic embryos of cattle and mouse with lentiviral vector[D]. Zhengzhou：Henan Agricultural University.] doi：10.7666/d.y1999567.

孫武，娜日蘇. 2015. 轉基因豬的研究進展[J]. 畜牧與獸醫，47（4）：134-137. [Sun W，Na R S. 2015. Progress in research of transgenic pig[J]. Animal Husbandry & Veterinary Medicine，47（4）：134-137.]

湯晗，聶建云，李文斌，董鳳萍. 2017. 慢病毒載體系統的發展及在腫瘤基因治療中的應用[J]. 現代腫瘤醫學，25（10）：1659-1662. [Tang H，Nie J Y，Li W B，Dong F P. 2017. Research progress of lentiviral vector system based on HIV-1[J]. Journal of Modern Oncology，25（10）：1659-1662.] doi：10.3969/j.issn.1672-4992.2017.10.038.

王軍. 2013. 細胞穿膜肽TAT與誘導多功能干細胞相關轉錄因子的融合表達及其穿膜能力研究[D]. 無錫：江南大學. [Wang J. 2013. Fusion expression and penetrating ability study of cell penetrating peptide TAT and induced pluripotent stem cell transcriptional factors[D]. Wuxi：Jiangnan University.]

許世艷，涂文嬌，朱科衡，劉瑜. 2021. 精子功能指標在輔助生殖助孕方式選擇中的作用[J]. 生殖醫學雜志，30（3）：337-342. [Xu S Y，Tu W J，Zhu K H，Liu Y. 2021. Effect of sperm function parameters on selection of assisted reproductive methods[J]. Journal of Reproductive Medicine，30（3）：337-342.] doi：10.3969/j.issn.1004-3845.2021. 03.010.

閆可心，閆宗斌，韓金成，張雪梅，薛書江，許應天. 2021. 細胞穿膜肽作為載體的研究進展[J]. 特產研究，43（6）：147-150. [Yan K X，Yan Z B，Han J C，Zhang X M，Xue S J，Xu Y T. 2021. Research progress of cell penetrating peptides as carriers[J]. Special Wild Economic Animal and Plant Research，43（6）：147-150.] doi：10.16720/j.cnki.tcyj. 2021.147.

Brackett B G，Baranska W，Sawicki W，Koprowski H. 1971. Uptake of heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through fertilization[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，68（2）：353-357. doi：10.1073/pnas.68.2.353.

Chaparian S，Abdulahnejad A，Rashidi F，Toghyani M，Gheisari A，Eghbalsaied S. 2016. Is passive transmission of non-viral vectors through artificial insemination of sperm-DNA mixtures sufficient for chicken transgenesis？[J]. The Journal of Reproduction & Development，62（3）：265-270. doi：10.1262/jrd.2015-176.

Gandolfi F. 2000. Sperm-mediated transgenesis[J]. Theriogeno-logy，53（1）：127-137. doi：10.1016/s0093-691x（99）00246-0.

Gong Z F，Ikongmova S P，Karlsson A J. 2018. Secondary structure of cell-penetrating peptides during interaction with fungal cells[J]. Protein Science，27（3）：702-713. doi：10.1002/pro.3364.

Guidotti G，Brambilla L，Rossi D. 2017. Cell-penetrating peptides：From basic research to clinics[J]. Trends in Pharmacological Sciences，38（4）：406-424. doi：10.1016/j.tips. 2017.01.003.

Hadar M，de Laté P L，Kennedy E J，Langsley G. 2018. Cell penetratingpeptides to dissect host-pathogen protein-protein interactions in Theileria-transformed leukocytes[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry，26（6）：1127-1134. doi：10.1016/j.bmc.2017.08.056.

Harel-Markowitz E，Gurevich M，Shore L S. 2009. Use of sperm plasmid DNA lipofection combined with REMI （restriction enzyme-mediated insertion） for production of transgenic chickens expressing eGFP（enhanced green fluorescent protein） or human follicle-stimulating hormone[J]. Biology of Reproduction，80（5）：1046-1052. doi：10. 1095/biolreprod.108.070375.

Jones S，Lukanowska M，Suhorutsenko J，Oxenham S，Barratt C，Publicover S，Copolovici D M，Langel ü，Howl J. 2013. Intracellular translocation and differential accumulation of cell-penetrating peptides in bovine spermatozoa：Evaluation of efficient delivery vectors that do not compromise human sperm motility[J]. Human Reproduction，28（7）：1874-1889. doi：10.1093/humrep/det064.

Katsuki T，Hara T，Ueda K，Tanaka J，Ohama K. 2005. Prediction of outcomes of assisted reproduction treatment using the calcium ionophore-induced acrosome reaction[J]. Human Reproduction，20（2）：469-475. doi：10.1093/humrep/deh636.

Lavitrano M，Camaioni A，Fazio V M，Dolci S，Farace M G，Spadafora C. 1989. Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs：Genetic transformation of mice[J]. Cell，57（5）：717-7231. doi：10.1016/0092-8674（89）90787-3.

Lavitrano M，Forni M，Bacci M L，Di Stefano C，Varzi V，Wang H J，Seren E. 2003. Sperm mediated gene transfer in pig：Selection of donor boars and optimization of DNA uptake[J]. Molecular Reproduction and Development，64（3）：284-291. doi：10.1002/mrd.10230.

Li Z Z，Wang X，Teng D，Mao R Y，Hao Y，Yang N，Chen H x，Wang X M，Wang J H. 2018. Improved antibacterial activity of a marine peptide-N2 against intracellular Salmonella typhimurium by conjugating with cell-penetrating peptides-bLFcin6/Tat11[J]. European Journal of Medicinal Chemistry，145（10）：263-272. doi：10.1016/j.ejmech.2017. 12.066.

Montini E，Cesana D，Schmidt M，Sanvito F，Ponzoni M，Bartholomae C，Sergi L S，Benedicenti F，Ambrosi A，Di Serio C，Doglioni C，von Kalle C，Naldini L. 2006. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration[J]. Nature Biotechnology，24（6）：687-696. doi：10. 1038/nbt1216.

P?rnaste L，Arukuusk P，Langel K，Tenson T，Langel ü. 2017. The formation of nanoparticles between small interfering RNA and amphipathic cell-penetrating peptides[J]. Molecular Therapy，7：1-10. doi：10.1016/j.omtn.2017.02.003.

Rádis-Baptista G，Campelo I S，Morlighem J é R L，Melo L M，Freitas V J F. 2017. Cell-penetrating peptides （CPPs）：From delivery of nucleic acids and antigens to transduction of engineered nucleases for application in transgenesis[J]. Journal of Biotechnology，252（20）：15-26. doi：10.1016/j.jbiotec.2017.05.002.

Rostami B，Irani S，Bolhassani A，Cohan R A. 2018. M918：A novel cell penetrating peptide for effective delivery of HIV-1Nef and Hsp20-Nef proteins into eukaryotic cell lines[J]. Current HIV Research，16（4）：280-287. doi：10. 2174/1570162X17666181206111859.

Servick K. 2022. Here?s how scientists pulled off the first pig-to-human heart transplant[J]. Science. doi：10.1126/science.ada0089.

Shen W，Li L，Pan Q J，Min L J，Dong H S，Deng J X. 2006. Efficient and simple production of transgenic mice and rabbits using the new DMSO-sperm mediated exogenous DNA transfer method[J]. Molecular Reproduction and Development，73（5）：589-594. doi：10.1002/mrd.20401.

Sperandio S，Lulli V，Bacci M L，Forni M，Maione B，Spadafora C，Lavitrano M.1996. Sperm-mediated DNA transfer in bovine and swine species[J]. Animal Biotechnology，7（1）：59-77. doi：10.1080/10495399609525848.

Wang F H，Wang Y，Zhang X，Zhang W J，Guo S R，Jin F. 2014. Recent progress of cell-penetrating peptides as new carriers for intracellular cargo delivery[J]. Journal of Controlled Release，174：126-136. doi：10.1016/j.jconrel.2013. 11.020.

收稿日期：2022-01-20

基金項目：國家自然科學基金項目（31860644）;國家現代農業產業技術體系廣西創新團隊建設項目（nycytxgxcxtd-2021-09-01）;廣西自然科學基金項目（2019GXNSFDA185002）

通訊作者：韋英明（1962-），https：//orcid.org/0000-0003-4458-9139，研究員，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究工作，E-mail：dkywym@163.com;楊素芳（1972-），https：//orcid.org/0000-0002-4648-0201，博士，教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究工作，E-mail：85997362@qq.com

第一作者：陳集成（1986-），https：//orcid.org/0000-0002-9091-1013，研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail：2035977949@qq.com