利用非靶向和靶向代謝組學鑒別荊條蜜、棗花蜜和洋槐蜜

劉進 張永貴 汪平凱 趙彤 趙柳微 吳黎明

（1 北京市園林綠化產業促進中心；2 中國農業科學院蜜蜂研究所）

蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結合后，在巢脾內轉化、脫水貯存至成熟的天然甜物質[1,2]，具有營養保健、傷口護理等功效[3-5]。蜂蜜的主要成分為糖類，占蜂蜜的65%～80%，糖類中以葡萄糖和果糖為主。另外，蜂蜜含有18%～22%的水，少量的蛋白質、酶、游離氨基酸、黃酮類物質、酚酸類物質、礦物元素以及微量元素[6]。常見的蜂蜜品種是按照蜜蜂采集的蜜源植物不同劃分的。我國地域遼闊，蜜源植物種類較多，能得到的商品蜜種類多達幾十種[7]。不同植物來源蜂蜜在品質特性、功能屬性和價格等方面差異很大，確定不同品種蜂蜜有助于實現蜂蜜的準確識別和優質優價。因此，建立簡單快速的蜂蜜鑒別手段至關重要。

蜂蜜品種的傳統檢測方法包括感官鑒別和花粉分析，其結果判斷帶有一定的主觀性，需要實驗員具有豐富的經驗和專業的知識背景[7]。近年來，鑒別蜂蜜品種的現代技術包括熒光定量PCR 技術[8,9]、DNA 條形碼技術[10]、紫外光譜技術[1,11]等，但上述方法存在一個共同點，即一個方法僅提供一種蜜源的鑒別，相比于同時鑒別幾種不同蜜源的蜂蜜，單一鑒別的方法耗時長，成本高。色譜技術可定性分析樣品中營養成分，結合質譜后可獲得營養成分的定量結果，對于分析樣本的特定物質含量具有優勢性[12]。本研究利用代謝組學和統計分析技術，對3種大宗蜂蜜——荊條蜜、棗花蜜和洋槐蜜的代謝物進行異同比對，通過超高效液相色譜-三重四級桿質譜技術（UHPLC-QqQ-MS/MS）對三種蜂蜜的差異化合物進行準確定量，旨在建立一種同時鑒別3種蜂蜜的方法，為蜂蜜差異性成分的研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜樣本均采自北京，包含3 種不同植物源單花種蜂蜜，分別為洋槐蜜（YH）、棗花蜜（ZH）和荊條蜜（JT）。其中，荊條蜜（n=23），棗花蜜（n=21），洋槐蜜（n=24）。所有樣本均于2021年8月采自蜂場中自然釀造的蜂蜜，收集于500mL 玻璃瓶，待測前貯存于4℃。

甲醇、乙腈：色譜純，美國MREDA 公司；甲酸：色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；咖啡酸（純度≥98%）、4-羥基喹啉（純度≥98%）、刺槐苷（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；Prime HLB 固相萃取小柱（200mg/6mL）：美國沃特世公司。

1.2 儀器與設備

移液槍：德國Eppendorf 公司；Vortex-Genie 2渦旋儀：美國Scientific Industry 公司；分析天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；超高效液相色譜—三重四極桿串聯質譜(UHPLC-QqQ-MS/MS)：6495，美國Agi1ent 公司；超高效液相色譜-飛行時間質譜（UHPLC/Q-Tof-MS）：6545，美國Agi1ent公司；高速離心機：湖南湘儀有限公司。

1.3 樣品前處理

準確稱取5±0.05g 蜂蜜樣品于50mL 離心管，加入10mL 水，渦旋1min，60kHz 功率超聲10min后4℃離心5min，待凈化。用5mL 甲醇，5mL 水活化固相萃取小柱，離心后樣品取上清液過柱凈化，流速約1d/3s，液體流完后，5mL 水淋洗，抽干，8mL 甲醇洗脫，氮氣吹干，2mL 甲醇復溶，過0.22μm濾膜，待檢測。

1.4 標準工作液的配制

準確稱取咖啡酸、4-羥基喹啉和刺槐苷標準品適量，用甲醇配成1mg/mL 的標準儲備液。將儲備液配置成濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.5、1、5、10 mg/L 的混合標準工作溶液。

1.5 非靶向代謝組學方法

色譜條件：

色譜柱：Agi1ent Ec1ipse P1us C18 (2.1×100mm，1.8μm)；柱溫：40℃；進樣量：2μL；流動相：A為水（含0.1%甲酸，v/v），B 為乙腈（含0.1%甲酸，v/v））；流速：0.3mL/min；梯度程序：0～2min，5% B；2～20min，5%～100% B；20～25min，100%B。

質譜參數：

電噴霧離子源（ESI）：正離子模式；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化器壓力：35 psi；鞘氣溫度：370 ℃；鞘氣流速：11 L/min；參比離子112.985587，1033.988109。

1.6 代謝物定性及數據分析

使用Agi1ent MassHunter Profinder B.10.0 軟件對原始數據進行峰對齊、峰歸屬等處理。基于Met1in數據庫及對照品對比，對質譜檢測的一級精準相對分子質量及二級碎片離子信息進行色譜峰的定性分析。使用SIMCA 14.1 軟件對數據進行標準化處理，隨后進行正交偏最小二乘回歸（OPLS-DA）有監督模型分析，并根據變量投影重要性（variab1e importance in projection,VIP）對組間分離貢獻大的化合物進行篩選。

1.7 UHPLC-QqQ-MS/MS檢測條件

色譜條件：

色譜柱：Agi1ent Ec1ipse P1us C18（2.1×100mm,1.8μm）；柱溫：40℃；進樣量：2μL；流動相：A為水（含0.1%甲酸，v/v），B：乙腈；流速：0.3mL/min；洗脫梯度：0～1min，5%B；1～2min，5%～35%B；2～3min，35%～50%B；3～5min，50%～75%B；5～5.1min，75%～100%B；5.1～7min，100%B；7～7.1min，100%～5%B；7.1～10min，5%B。

質譜條件：

ESI 源：正、負離子模式；干燥氣溫度：325 ℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化器壓力：35 psi；鞘氣溫度：370 ℃；鞘氣流速：11 L/min。

2 結果與分析

2.1 非靶向代謝組學分析

OPLS-DA 可以最大化組間差異，被廣泛用于代謝組學數據分析[13]。為明確不同單花蜂蜜中化合物的差異性，結合UHPLC/Q-Tof-MS 的相關數據，采用SIMCA 進行分析，繪制蜂蜜樣品OPLS-DA 得分圖（見圖1）。將不同單花蜂蜜分為3 組：A 組—洋槐蜜；B 組—棗花蜜；C 組—荊條蜜。由圖1可知，3 組樣本完全分離，無重疊區域，分類效果較好，表明3 種單花蜂蜜具有明顯的差異性。

進一步利用VIP 值分析尋找能有效區分3 種蜂蜜的標志性成分。通常認為VIP 值大于1 則表示該參數屬于植物源鑒定中重要的標記指標，而VIP 值小于0.5 則表示該參數對于鑒定結果不重要[14]。本研究從大量差異化合物中篩選出4-羥基喹啉、刺槐苷和咖啡酸作為棗花蜜、洋槐蜜和荊條蜜的標志性成分。4-羥基喹啉、刺槐苷和咖啡酸的VIP 得分分別為13.25，1.65 和0.76。

2.2 蜂蜜中咖啡酸、4-羥基喹啉和刺槐苷的定量方法

2.2.1 UHPLC-QqQ-MS/MS 質譜條件優化

UHPLC-QqQ-MS/MS 是物質定量的有力工具，其靈敏度高，定量準確。文章優化了UHPLC-QqQMS/MS 的錐孔電壓，使母離子信號強度達到最大。在最優的錐孔電壓下開啟碰撞能，信號最強的子離子為定量離子，信號強度次之的為定性離子。并優化離子對碰撞能，使定性、定量離子信號強度達到最大，最后進行MRM 監測2 對離子對[15]。3 種化合物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量如表1所列。

表1 分析物的保留時間及質譜分析條件

3 種標志性成分的色譜圖見圖2。3 種分析物均達到基線分離，各成分之間無干擾。表明本方法專屬性良好，符合定量分析要求。

2.2.2 方法學驗證

將制備的標準品混合工作液，以峰面積（Y）為縱坐標，對照品質量濃度（X）為橫坐標，建立標準曲線，計算3 種標志成分的線性方程及相關系數R2。結果顯示，3 種標志成分的相關系數（R2）均大于0.99，表明質量濃度在相應范圍內與峰面積具有良好的線性關系，具體結果見表2。

表2 3種蜂蜜中標志成分的檢出限（LOD）、定量限（LOQ）和線性范圍

以信噪比S/N=3 為檢出限（LOD），S/N=10 為定量限（LOQ），計算得咖啡酸、4- 羥基喹啉和刺槐苷的LOD 分別為0.006mg/kg、0.009mg/kg 和0.003mg/kg。LOQ 分別為0.02mg/kg、0.03mg/kg 和0.01mg/kg。

為評估分析方法的回收率與相對標準偏差（RSD），將不同濃度的3 種標志性成分混合標準溶液添加到空白蜂蜜樣品中進行加標回收實驗，加標水平分別為0.5mg/kg、1mg/kg 和2mg/kg，實驗重復5 次。結果表明，咖啡酸、4-羥基喹啉和刺槐苷的回收率分別為80.5%～90.1%、90.7%～93.7%和75.2%～87.7%，RSD 分別為1.2%～8.0%、2.8%～14.8和1.3%～4.4%。表明該方法的準確性和精密度滿足蜂蜜樣品的分析要求。具體結果見表3。

表3 3種蜂蜜中標志成分的基質效應和回收率（%/n=5）

基質效應是指共流出干擾物對目標物離子造成離子抑制或增強的效應，基質效應在質譜分析中普遍存在。本研究采用蜂蜜空白基質對基質效應進行考察，分別制備溶劑標準溶液和基質標準溶液，測得溶劑標準曲線和基質標準曲線的斜率。基質效應=(基質標準曲線斜率-溶劑標準曲線斜率)/溶劑標準曲線斜率×100%。基質效應的絕對值隨著基質效應的增強而變大，基質效應為正值說明基質增強，負值則為基質抑制。當基質效應絕對值＜20%時表示基質效應微弱，基質效應絕對值在20%～50%范圍時表示具有中等強度基質效應，基質效應絕對值＞50%時表示基質效應較強[16,17]。咖啡酸、4-羥基喹啉和刺槐苷在蜂蜜中的基質效應分別為-7.0%、3.2%和-29.2%，說明咖啡酸和4-羥基喹啉具有微弱基質效應，而刺槐苷具有中等強度基質效應，本實驗采用基質工作溶液定量以減小基質效應的影響。

2.2.3 實際樣品測定

取荊條蜜樣23 個，棗花蜜樣21 個，洋槐蜜樣24 個，測定其中咖啡酸、4-羥基喹啉和刺槐苷的含量，結果見圖3。蜂蜜樣本中咖啡酸的含量由高到低為荊條蜜、棗花蜜和洋槐蜜，其含量分別為1.82～6.01mg/kg、0.03～1.57mg/kg 和0.09～0.35mg/kg；蜂蜜樣本中4-羥基喹啉的含量由高到低為棗花蜜、荊條蜜和洋槐蜜，其含量分別為0.45～2.9mg/kg、0.06～0.35mg/kg 和0.02～0.25mg/kg；蜂蜜樣本中刺槐苷的含量由高到低為洋槐蜜、棗花蜜和荊條蜜，其含量分別為0.12～0.97mg/kg、0.01～0.32mg/kg 和0～0.02mg/kg。同時分析了20 個油菜蜂蜜和椴樹蜂蜜中咖啡酸、刺槐苷、4-羥基喹啉的含量，發現在油菜和椴樹蜂蜜中能夠檢出少量咖啡酸（顯著低于設定閾值），但是均未檢出刺槐苷和4-羥基喹啉。

本實驗研究結果顯示，排除少量異常值后，荊條蜜中咖啡酸的含量顯著高于洋槐蜜和棗花蜜，可作為荊條蜜的特征物，其閾值建議大于1.6 mg/kg；棗花蜜中4-羥基喹啉顯著高于荊條蜜和洋槐蜜，可作為棗花蜜的特征物，其閾值建議大于1.0 mg/kg；洋槐蜜中刺槐苷明顯高于荊條蜜和棗花蜜，可作為洋槐蜜的特征物，其閾值建議大于0.4 mg/kg。

3 結論

本文采用非靶向和靶向代謝組學技術對荊條蜜、棗花蜜和洋槐蜜進行研究，發現咖啡酸、4-羥基喹啉和刺槐苷對3 種蜂蜜的鑒別具有關鍵性作用。采用超高效液相色譜—三重四極桿質譜（UHPLCQqQ-MS/MS）技術建立了同時測定蜂蜜中咖啡酸、4-羥基喹啉和刺槐苷的方法。采用該方法分析北京及周邊地區荊條蜜、棗花蜜和洋槐蜜樣品中的咖啡酸、4-羥基喹啉和刺槐苷的含量，確定咖啡酸、4-羥基喹啉和刺槐苷可分別作為荊條蜜、棗花蜜和洋槐蜜的標志性成分，其閾值分別為1.6 mg/kg、1.0 mg/kg 和0.4 mg/kg。該方法可滿足3 種蜂蜜樣品的快速鑒別，也可為蜂蜜鑒別提供有利的手段和可靠的思路。