TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞的影響

魏耀昶，劉青云，程佳瑞，鄒超霞，鄧彥飛

（廣西大學動物科學技術學院亞熱帶生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西 南寧 530004）

因水牛具有耐粗飼、耐高溫、抗病力強，以及奶營養價值高等優勢，水牛養殖業已成為廣西的特色支柱產業。但是水牛卵巢生長卵泡少，卵泡閉鎖率高，嚴重制約了水牛產業的發展。因此，探究水牛卵泡發育和卵泡閉鎖機制有助于提高水牛繁殖效率。

顆粒細胞的凋亡被認為是卵泡閉鎖的重要誘導因子[1]，其增殖分裂、調亡、分泌的類固醇激素和細胞因子對卵泡的發育及閉鎖起著至關重要的調節作用，卵母細胞所需的營養物質如核酸、能量是通過顆粒細胞獲得的[2]。卵泡中10%以上的顆粒細胞凋亡后，認為該卵泡已經閉鎖；因細胞凋亡是不可逆的，所以卵泡閉鎖也是不可逆轉的，一旦發生閉鎖，卵泡就不能繼續正常發育。

TGF-β超家族是一組結構保守但功能多樣的蛋白質，在脊椎動物中至少有35個成員。這些蛋白質廣泛分布于全身，作為細胞外配體參與產前和產后的許多生理過程。大多數TGF-β超家族成員通過與細胞表面指定為I型和II型的兩種絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結合并形成異源四聚體復合物，對靶細胞發揮作用[3]。越來越多的試驗證據支持它們在卵泡發育的多個方面發揮關鍵作用的說法，包括原始卵泡募集、顆粒和卵泡膜細胞增殖/閉鎖、類固醇生成、促性腺激素受體表達、卵母細胞成熟、排卵、黃體化和黃體（CL）形成[4-5]。然而，關于TGF-β調節顆粒細胞狀態的研究仍然有爭議。有報道顯示，TGF-β可以通過smad通路增加顆粒細胞的凋亡率[6-7]。也有報道顯示，TGF-β單獨作用對顆粒細胞無影響，而TGF-β與 TGF-α協同作用就可以誘導顆粒細胞凋亡，促進卵泡閉鎖[8]。

為了進一步探究TGF-β對卵泡顆粒細胞的影響，本研究以水牛為對象，重點關注TGF-β對水牛顆粒細胞狀態的影響，為研究TGF-β對卵泡發育的影響提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM高糖基礎液體培養基（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、青霉素/鏈霉素和胰酶均購自北京索萊寶公司；CCK-8試劑購自諾唯贊生物科技有限公司；BD pharmingen FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit1購自BD生物科技公司；牛孕酮和雌激素ELISA檢測試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；TGF-β購自北京索萊寶公司。

1.2 水牛卵泡顆粒細胞的體外培養

從南寧當地屠宰場采集非妊娠水牛的卵巢，放入37℃滅菌生理鹽水，1 h內運回實驗室進行試驗。卵巢先用75%的酒精潤洗消毒，剪下多余的卵巢系膜組織，之后用37℃生理鹽水清洗3遍，將血水洗凈。將清洗干凈的卵巢置于高壓滅菌后的紗布上，選取3～9 mm的卵泡，用15 mL注射器吸取卵泡中的卵泡液，并收集在離心管中。將收集的卵泡液用40μm的細胞篩過篩，收集液體，1500 rpm離心3 min。棄上清，用含雙抗的PBS清洗顆粒細胞3遍，并離心棄上清。用含雙抗和10%胎牛血清的DMEM重懸顆粒細胞，并置于培養皿中培養（37 ℃，5% CO2），12 h 后更換無雙抗的DMEM。

1.3 CCK-8檢測

取對數生長期的水牛卵泡顆粒細胞培養在96孔板中，用 0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL濃度的 TGF-β 分別于 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h（每組3個重復）處理水牛卵泡顆粒細胞。分別向每個孔中添加10μL CCK-8試劑，在培養箱中繼續培養2 h。利用酶標儀（TECAN公司）在450 nm處檢測OD值。

1.4 流式細胞術檢測

取對數生長期的水牛卵泡顆粒細胞培養在24孔板中。根據CCK-8結果選取20 ng/mL的濃度，分別于 1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、24 h、48 h （每組 3 個重復）處理水牛卵泡顆粒細胞。用胰酶消化后將細胞收集在1.5 mL離心管中，并用PBS清洗1次。加入500μL binding buffer，輕柔吹打均勻后，分別加入5 μL Annexin V FITC和10μL PI。吹打混勻后 15 min內利用流式細胞儀檢測。

1.5 孕酮和雌激素的檢測

取對數生長期的水牛卵泡顆粒細胞培養在24孔板中。根據CCK-8結果選取20 ng/mL的濃度培養水牛卵泡顆粒細胞24 h。收集細胞培養液，用ELISA試劑盒檢測培養液中E2和PROG濃度。用酶標儀(TECAN)按照制造商的方案檢測樣品。E2和PROG的檢測范圍分別為40～1 000 pg/mL和0.15～70 ng/mL。檢測靈敏度分別為40 pg/mL和0.5 ng/mL，檢測內變異系數均小于15%。

1.6 統計學方法

所有數據采用GraphPad Prism 8.0進行分析。兩組間的統計學差異采用t檢驗，超過兩組的統計學差異采用方差分析（ANOVA）。P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞增殖的影響

為了檢測TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞增殖的影響，本試驗利用CCK-8試劑盒分別檢測了不同濃度和不同處理時間后的OD值。結果發現，隨著TGF-β濃度的升高，OD值逐漸升高（如圖1所示），TGF-β在不同培養時間下，OD值逐漸上升的趨勢不變，證明TGF-β可以促進水牛卵泡增殖。當TGF-β添加劑量為20 ng/mL時，無論培養多長時間，其OD值都顯著高于其他處理組，在處理24 h后，隨著TGF-β濃度的升高，OD值不再增加。

圖1 TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞增殖的影響

2.2 TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞凋亡的影響

為檢測TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞凋亡的影響，本試驗使用流式細胞術分別檢測了添加20 ng/mL的TGF-β作用不同時間卵泡顆粒細胞的凋亡率。結果發現，用20 ng/mL的TGF-β處理水牛卵泡顆粒細胞后，細胞凋亡率沒有顯著變化，且隨著處理時間的延長，卵泡顆粒細胞的凋亡率仍然沒有顯著變化（如圖2-1、2-2所示）。

圖2-1 TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞凋亡的影響

圖2-2 TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞凋亡的影響

2.3 TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞分泌孕酮（P4）的影響

在卵泡發育過程中，類固醇激素的生成和分泌對卵泡閉鎖有直接影響。本研究利用ELISA檢測了添加20 ng/mL的TGF-β處理水牛卵泡顆粒細胞24 h后，細胞培養液中的孕酮含量。結果顯示，用20 ng/mL的TGF-β處理水牛卵泡顆粒細胞24 h后，可以顯著降低水牛卵泡顆粒細胞孕酮的分泌量（如圖3所示）。

圖3 TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞分泌孕酮（P4）的影響

2.4 TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞分泌雌激素（E2）的影響

分泌雌激素是卵泡顆粒細胞最重要的功能之一。本研究利用ELISA檢測了添加20 ng/mL的TGF-β處理水牛卵泡顆粒細胞24 h后，細胞培養液中雌激素的含量。結果顯示，用20 ng/mL的TGF-β處理水牛卵泡顆粒細胞24 h后，細胞培養液中雌激素的含量沒有顯著變化（如圖4所示）。

圖4 TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞分泌孕酮（E2）的影響

3 討論

顆粒細胞的凋亡對卵泡閉鎖至關重要，細胞凋亡是機體自發的程序性死亡，而促使卵泡顆粒細胞凋亡的因素眾多。生殖激素是影響卵泡顆粒細胞增殖、生長和凋亡最重要的因素，并且幾乎所有的生殖激素都參與其中，如 GnRH[9]、FSH[10]、LH[10]等。 在與凋亡相關基因的研究中發現， 促凋亡基因（FAS、P53、BCL2、BAX、Cas-3、Cas-9等）在卵泡閉鎖中可以促進顆粒細胞的凋亡[11]。另外在卵泡閉鎖期間，不僅促凋亡基因Bcl-2家族的表達升高，而且抗凋亡基因的表達在轉錄水平上增加，在閉鎖卵泡中Bid、Bim、Bcl-2和Mcl-1基因高表達，而caspase-3、BAX和BCL-xl基因在閉鎖卵泡中高表達[12]。細胞因子存在相互協同、相互制約等作用，生物學功能復雜，已經有大量研究證實了各類細胞因子在卵泡顆粒細胞凋亡過程中的作用。據報道，EGF刺激卵泡顆粒細胞的增殖，增加黃體酮、cAMP、cGMP的釋放，控制雌二醇的釋放，此外它刺激卵母細胞成熟、卵丘細胞增殖及維持卵泡存活[13]。10 ng/mL FGF-2可以抑制細胞凋亡并促進羊卵泡的生長[14]。有大量研究顯示，轉化因子TGF-β對卵泡發育至關重要，然而對TGF-β的研究還存在爭議。

本試驗結果顯示，在體外培養的水牛卵泡顆粒細胞中添加TGF-β后可以顯著增加水牛卵泡顆粒細胞的增殖能力，而對凋亡沒有顯著影響。這說明TGF-β對水牛卵泡顆粒細胞沒有負面影響，更有利于水牛卵泡的發育。同時，本試驗結果顯示，TGF-β可以顯著抑制水牛卵泡顆粒細胞產生孕酮，而對雌激素沒有影響，這使得孕激素與雌激素的比例減少。據報道，卵泡中E2和P4的失衡與卵泡閉鎖有關，在卵泡閉鎖的過程中，E2濃度相對降低，P4濃度相對升高,兩者比例變化已成為鑒定卵泡閉鎖與否的重要指標[15]。因此，TGF-β可以減少孕酮與雌激素的比例，抑制水牛卵泡的閉鎖。然而，TGF-β到底通過什么途徑影響水牛卵泡顆粒細胞的狀態，還需要進一步的研究。

4 結論

TGF-β可以通過促進水牛卵泡顆粒細胞的增殖、減少孕激素與雌激素的比例來減少水牛卵泡的閉鎖，增加卵泡顆粒細胞的活力。