宮腔灌注粒細胞集落刺激因子對薄型子宮內膜解凍移植的影響

梁俊霞 張麗 張玉 田瑛 閆蒙 邵云

子宮內膜厚度低于能夠獲得妊娠的閾厚度稱為薄型子宮內膜[1]。關于薄型子宮內膜的定義各家報道不同，目前常用的界定厚度為<7 mm[2]。薄型子宮內膜發生與炎癥、藥物及醫源性損傷等有關。研究發現，卵巢刺激周期中薄型子宮內膜發生率高達38%～66%，體外受精-胚胎移植中薄型子宮內膜發生率為1%～2.5%[3]。由于薄型子宮內膜容易導致妊娠率及胎兒活產率明顯降低，而采取輔助生殖技術助孕時，取消移植的概率增加，因此，改善子宮內膜厚度成為提高輔助生殖技術成功率的關鍵因素之一。人粒細胞集落刺激因子(Human granulocyte colony stimulating factor,G-CSF)是由多種細胞合成的一種特殊細胞因子。研究發現[4]，G-CSF參與了女性生殖系統中卵泡生長發育、排卵、子宮內膜生長、胚胎種植和妊娠維持等諸多方面，對女性生殖功能的維持和調控發揮了重要的促進作用。因此,本研究探討宮腔灌注G-CSF對于薄型子宮內膜患者凍融胚胎移植(frozen thawed embryo transfer，FET)結局的影響。

對象與方法

1.研究對象:回顧性分析2018年1月至2019年12月在河北省計劃生育科學技術研究院和河北省生殖醫院生殖科就診行FET患者的臨床資料，采用宮腔灌注治療的薄型子宮內膜患者76例作為研究組，年齡22～40歲，平均年齡(33.2±4.4)歲。選擇同期未采用宮腔灌注治療，且符合納入標準，無剔除標準的44例患者作為對照組，年齡21～40歲，平均年齡(33.9±4.9)歲。另將研究組患者的上一個HRT+FET周期(或HRT周期)作為自身對照組(前周期組)。

納入標準包括(1)激素替代治療(hormone replacement therapy，HRT)解凍移植周期；(2)年齡≤40歲，體質指數(Body Mass Index，BMI)18.5～28 kg/m2；(3)既往至少一個HRT/HRT-FET周期，內膜轉化日內膜厚度<7 mm；(4)尚有1個以上卵裂期D3天胚胎(其中至少一個優質胚胎)冷凍保存。排除標準包括(1)宮腔鏡檢查提示中、重度宮腔粘連；(2)子宮畸形和子宮內膜病變；(3)輸卵管積水；(4)生殖器、盆腔急性感染期的患者；(5)對G-CSF過敏或禁忌癥者。

2.子宮內膜的準備方案:月經第3天起口服戊酸雌二醇片(商品名：補佳樂,拜耳醫藥)2 mg,每日3次,月經第 12天子宮內膜厚度≥7 mm,血E2值>100 pg/mL時添加黃體酮注射液(浙江仙居),每日40 mg 肌肉注射3 d后行D3胚胎移植。若內膜厚度未達到上述指標，將繼續口服戊酸雌二醇片至18 d。所有患者均自月經干凈起口服阿司匹林腸溶片75 mg/d。移植后戊酸雌二醇繼續使用,地屈孕酮片(商品名：達芙通,雅培制藥,荷蘭)10 mg,每日2次,黃體酮陰道緩釋凝膠(8%)(商品名：雪諾酮，默克雪蘭諾，英國)90 mg，每日1次進行黃體支持。FET術后14～16 d，血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)≥20 U/L為生化妊娠，繼續黃體支持，FET術后28～30 d行陰道超聲檢查，觀察到孕囊即為臨床妊娠，孕囊數即為胚胎種植數。

3.宮腔灌注操作方法:研究組患者口服戊酸雌二醇(商品名：補佳樂,拜耳醫藥)第7天，陰道超聲測量子宮內膜厚度、形態及血流動力學參數后，行宮腔灌注治療。患者取膀胱截石位，以0.1%碘伏消毒外陰及陰道，鋪無菌孔巾，窺陰器暴露宮頸，無菌生理鹽水棉球擦拭宮頸。將人工授精管和1 mL注射器組合灌注器，抽吸G-CSF 150 μg (國藥準字S19991017)0.6 mL，將人工授精管插入宮頸口，緩慢將藥液注入宮腔。灌注后患者墊高臀部臥位30 min。灌注5 d后復查陰道超聲測量子宮內膜厚度、形態及血流動力學參數。

4.陰道超聲測量方法:由同一位高年資醫師使用PHILIPS-EPIQ7彩色多普勒超聲診斷儀進行測量。3D9-3v陰道探頭頻率5.0 MHz。測量內容包括(1)子宮內膜厚度。即子宮的中矢狀平面中測量子宮內膜-子宮肌層連接的2個界面之間的最大距離[5]。(2)子宮內膜形態。參考Gonen[6]分型分為A型、B型、C型三型。(3)血流分型參考Shokeir[7]，分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。記錄兩側子宮動脈搏動指數(pulsate index，PI) 、阻力指數(resistance index，RI) 、收縮期峰值流速/舒張末期流速(systolic peak velocity /diastolic velocity，S/D) 值。

5.評價指標:子宮內膜厚度、形態及內膜血流，平均PI=(左側PI+右側PI)/2，平均RI=(左側RI+右側RI)/2,平均S/D=(左側S/D+右側S/D)/2，周期取消率、臨床妊娠率、種植率。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期數×100%，種植率=孕囊數目/移植胚胎總數×100%。

6.統計學處理:應用IBM-SPSS20.0軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數比較采用完全隨機設計單因素方差分析。計數資料用率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

1.一般情況:三組患者的年齡、BMI、不孕年限和轉化日孕酮(P)水平比較，差異均無統計學意義。見表1。

表1 三組患者一般情況比較

2.三組患者的子宮內膜厚度、子宮動脈血流參數比較:完全隨機設計單因素方差分析發現，各組子宮內膜厚度和RI差異均有統計學意義；子宮動脈PI值和S/D值差異均無統計學意義。進一步LSD多重檢驗發現，研究組灌注后子宮內膜厚度明顯厚于灌注前、對照組和前周期組，差異均有統計學意義。研究組灌注后子宮動脈RI值與前周期組比較,差異有統計學意義。見表2。

表2 三組患者子宮內膜厚度及子宮動脈血流參數的比較

3.三組患者子宮內膜形態及內膜血流情況比較:A型形態子宮內膜占比在各組間比較，差異均無統計學意義。II型血流子宮內膜占比在各組間比較，差異均有統計學意義。見表3。

4.三組患者FET結局的比較:(1)取消率。研究組的周期取消率明顯低于前周期組，組間差異有統計學意義；但研究組與對照組的周期取消率組間差異無統計學意義。(2)臨床妊娠率。研究組的妊娠率高于對照組，差異有統計學意義。研究組和前周期組的妊娠率、對照組和前周期組的妊娠率組間差異均無統計學意義。(3)種植率。研究組與對照組的種植率比較，差異有統計學意義。研究組和前周期組的種植率、對照組和前周期組的種植率組間差異均無統計學意義。見表4。

表3 三組患者子宮內膜形態及內膜血流情況比較

表4 三組患者FET結局的比較

討論

在胚胎種植的過程中，人類子宮內膜僅在極短時間內才能允許胚胎的植入，而這段時間稱為“種植窗”。除胚胎質量外，子宮內膜容受性也是妊娠成功的關鍵因素。薄型子宮內膜是導致子宮內膜容受性降低的原因之一。因此，增加薄型子宮內膜患者子宮內膜厚度，改善內膜容受性，是提高輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)成功率的關鍵。G-CSF是一種糖蛋白，具有免疫調節、保護血管、促進血管發生的作用。G-CSF在哺乳動物的成功妊娠中具有重要的作用,其在卵巢顆粒細胞、睪丸間質細胞、胎盤、子宮內膜細胞中均有表達,它可能參與了人卵泡顆粒細胞、胎盤及子宮內膜的生長、發育[8]。Zhao等[9]在薄型子宮內膜大鼠模型中研究發現，皮下注射G-CSF，能使大鼠內膜明顯增厚，細胞角蛋白和波形蛋白表達明顯增強，認為G-CSF能促進子宮內膜細胞再生修復，且早期給予G-CSF內膜增殖效果更好。Gleicher等[10]的一項隊列研究顯示,在人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)注射日宮腔灌注G-CSF(300μg)，可使患者的平均子宮內膜厚度由6.4 mm增加至9.3 mm,并獲得19.1%繼續妊娠率。因而認為宮腔灌注G-CSF對薄型子宮內膜具有促進增殖的作用。本研究宮腔灌注的G-CSF藥物劑量為150 ug，研究結果顯示，研究組灌注后子宮內膜厚度明顯高于灌注前、對照組和前周期組，提示宮腔灌注150 ug的G-CSF也同樣能改善薄型子宮內膜的厚度。

目前,子宮內膜容受性與子宮動脈血流動力學參數的相關性研究表明，子宮內膜厚度與子宮動脈血流動力學參數之間有相關關系[11]。子宮內膜血流間接反應胚胎種植部位的微環境。孫瑩璞等[12]通過雙側子宮血流動力學參數變化評價移植前子宮內膜容受性的研究結果顯示，hCG注射日子宮動脈PI 和RI 越高,子宮內膜越薄。本研究結果顯示，灌注后II型血流子宮內膜占比比灌注前和前周期組高，但研究組灌注后與對照組比較，差異無統計學意義；研究組灌注后子宮動脈RI與前周期組比較,組間差異有統計學意義；但子宮動脈PI值和S/D值在研究組灌注后、灌注前、對照組和前周期組四組之間比較，差異均無統計學意義。因此，推斷宮腔灌注G-CSF可能通過改善子宮內膜血流來增加內膜厚度，但尚不能推斷宮腔灌注G-CSF可改善子宮動脈相關參數。

研究表明[13],在既往卵巢刺激周期或凍胚移植周期出現薄型子宮內膜的患者，在再次凍胚移植時，采用激素替代方案實施凍胚移植同時予以多次的宮腔灌注G-CSF可以減少移植的取消率、增加移植內膜的厚度并提升胚胎的種植率和妊娠率。本研究顯示，研究組周期取消率明顯低于前周期組，但研究組與對照組周期取消率比較,差異無統計學意義。表明,對于既往因薄型內膜周期取消移植的患者，宮腔灌注G-CSF可以改善內膜厚度，增加移植的機會。

一項納入2個RCT、5個非RCT和7個隊列研究的Meta分析[14]顯示，G-CSF灌注治療可明顯改善子宮內膜厚度，提高臨床妊娠率并降低人工周期取消率，但在胚胎種植率方面沒有明顯提高。同時，該研究將患者的年齡進一步分層顯示，年齡 ≤39歲的患者，G-CSF灌注可以改善子宮內膜厚度，提高臨床妊娠率和胚胎種植率。本研究納入的研究對象年齡≤40歲，研究組的妊娠率和種植率均高于對照組，但研究組和前周期組，對照組和前周期組的妊娠率、種植率比較，差異均無統計學意義。提示，宮腔灌注G-CSF可能使一部分薄型子宮內膜患者獲益，但并不能使不加選擇的所有患者改善FET結局。因此，在未來的臨床實踐和設計研究中，需要甄別哪些患者將是是宮腔灌注G-CSF潛在的獲益者，從而確定宮腔灌注G-CSF的適應癥，以提高宮腔內灌注G-CSF臨床和研究價值。

雖然宮腔灌注G-CSF對改善薄型子宮內膜患者FET結局的研究在學界方興未艾，但對于最佳的給藥途徑、給藥時間、給藥劑量都尚未達成共識，導致各個研究結論不盡相同。此外，本研究因樣本量較小、未能對FET流產率、異位妊娠率和子代的健康情況進行觀察。

綜上所述，宮腔灌注G-CSF治療可改善薄型子宮內膜厚度，降低激素替代FET周期取消率，提高胚胎種植率和妊娠率。