優化樣品留取方法可提高囊胚培養液中游離DNA整倍性的檢測效率

黃錦 加加林 黨玉姣 喬杰 劉平

非整倍體胚胎是導致體外受精-胚胎移植(invitro fertilization-embryotransfer,IVF-ET)妊娠率降低、流產率增高的一個重要因素。臨床上，可以利用胚胎植入前遺傳學整倍體檢測技術(preimplantation genetic testing for aneuploidy，PGT-A)選擇整倍體的胚胎移植，提高IVF-ET的妊娠結局[1-2]。但是，PGT技術需要胚胎活檢，對胚胎是有創操作[3]；而且，由于胚胎存在嵌合的現象，活檢的細胞只能在一定程度上代表胚胎的結果[4]。因此，尋求一種無創的、更全面反映胚胎的方法進行胚胎整倍體檢測已成為該領域的熱點研究內容之一。

胚胎培養液中存在游離DNA(cell free DNA，cf DNA),近年來，越來越引起生殖領域的關注。已經有學者利用囊胚培養液中cfDNA檢測囊胚的整倍性[5-6]。由于胚胎培養液中游離DNA來源復雜且含量極少，給檢測的準確性帶來困難，限制了在臨床上的應用。如何采集培養液標本，采集何種時段的培養液標本對于胚胎的診斷至關重要。因此，本研究針對培養液的不同采集方法與整倍性檢測進行研究。

對象與方法

一、研究對象

本研究共納入239枚囊胚，所有的胚胎均來源于北京大學第三醫院生殖中心的PGT-A周期。納入患者的PGT-A指征為女方高齡(>38歲)、復發性流產、反復著床失敗。本研究獲得北京大學第三醫院醫學倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

二、方法

1.促排卵和受精方式：按照本中心常規用藥及監測方案進行控制性超排卵，注射hCG后36 h經陰道B超引導下卵泡穿刺取卵。所有周期都采用單精子卵母細胞內注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)方式受精。受精后16～18 h觀察受精情況，第三天選擇4細胞以上、碎片<50%的胚胎(多原核來源胚胎除外)進行囊胚培養。

2.PGT-A胚胎活檢與遺傳診斷：胚胎培養至第5～6天，選擇4期以上、滋養層細胞或者內細胞團其中一項評級為B以上的囊胚(Gardner評分標準[7])進行活檢，激光活檢3～5個滋養層細胞。活檢的滋養層細胞采用SNP芯片檢測胚胎的整倍性進行遺傳檢測，SNP array 芯片采用ILLUMINA公司的Human CytoSNP 12V-2.1芯片，活檢后的細胞采用多重置換擴增(multiple dilacement amplification, MDA)方法全基因組擴增后，雜交至芯片，掃描后的數據采用Illumina Genome Studio軟件分析。活檢后的囊胚進行玻璃化冷凍。

3.培養液收集與檢測：胚胎在D3天更換囊胚培養液，并采取單胚胎單獨培養，收集可以PGT-A活檢囊胚的培養液。收集方法分為三個階段，即(1)第一階段。胚胎D3天打孔后轉入囊胚培養液，收集D3～D5/D6的培養液；(2)第二階段。胚胎D3天打孔后轉入囊胚培養液，D4天再轉入另一新的培養液，收集D4-D5/D6的培養液；(3)第三階段。胚胎不做打孔處理，D3天再次用合適內徑的剝卵針輕柔地去除顆粒細胞后轉入囊胚培養液，D4再轉入另一新的培養液，收集D4～D5/D6的培養液。

囊胚活檢后，留取相應的培養液滴至PCR管中，-20℃保存。囊胚在活檢前不進行皺縮，所有收集的囊胚培養液樣本不含有囊胚皺縮后產生的囊腔液。所有樣本均進行無創胚胎染色體整倍性篩查(noninvasive preimplantation genetic testing for aneuploidy,NiPGT-A)檢測整倍性,即先將樣本進行多次退火環狀循環擴增(multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC)擴增后，采用二代測序(next generation sequencing,NGS)方法檢測整倍性[8]。

4.胚胎移植：PGT-A結果為整倍性的胚胎可以移植。所有周期均采用解凍單囊胚移植。本研究中共有56枚PGT-A整倍性胚胎移植，分析對應胚胎的NiPGT-A結果，統計臨床妊娠結局。

5.統計學處理:背靠背獲得囊胚的PGT-A結果和培養液的NiPGT-A結果。分析NiPGT-A方法的檢出率、NiPGT-A結果與PGT-A結果倍性一致性、整倍體符合率、非整倍體符合率、顆粒細胞污染率等。

結 果

239枚囊胚中209枚囊胚有NiPGT-A結果，NiPGT-A檢出率為87.5%(209/239)。隨著采樣方法的改進，NiPGT-A結果與PGT-A結果倍性一致性、整倍體符合率逐漸提高，顆粒細胞污染率逐漸降低。見表1。

表1 不同采樣階段培養液中游離DNA整倍性與囊胚滋養層細胞整倍性的結果比對Table 1 Comparison of NiPGT-A and PGT-A results at different sampling phases

239枚胚胎中有56枚PGT-A整倍體的胚胎移植，其中23枚胚胎的結局為活產/持續妊娠。NiPGT-A沒有結果的胚胎妊娠率較高(71.4%，5/7)，高于NiPGT-A為整倍體或者非整倍體胚胎的臨床妊娠結局(整倍體：33.3%，9/27；非整倍體：40.9%，9/22)。見表2。

表2 移植胚胎的NiPGT-A結果與妊娠結局的關系Table 2 Relationship between NIPGT-A results of embryo transfer and pregnancy outcome

討 論

2013年，分別有學者在囊胚腔液和胚胎培養液中發現有游離的DNA，可用于預測胚胎遺傳學或形態學特征[5-6]。由于囊胚腔液極少而且獲取不易，不論是顯微操作法或者囊胚皺縮法均對胚胎是有創操作。因此，國內外許多學者將研究焦點集中在囊胚培養液中cf DNA。

囊胚培養液的體積很小，大約10～50微升左右，其中的cf DNA含量甚至少于單細胞DNA的含量，這些都給該領域的研究帶來困難。目前，囊胚培養液cf DNA與對應囊胚的整倍體關系研究頗多[8-10]。2016年，有學者報道已經利用該技術分娩健康嬰兒[8]。然而，更多的研究顯示，培養液中cf DNA的整倍性與胚胎的一致性并不穩定。Vera-Rodriguez等研究發現[11]，培養液中cf DNA的整倍性與PGT周期的滋養層細胞活檢的符合率僅有67%。Capalbo 等的研究提示[12]，在PGT-M周期，囊腔液cf DNA與滋養層細胞活檢的符合率僅2.9%(2/69),培養液cf DNA與滋養層細胞活檢的符合率20.8%(15/72)；在PGT-A周期中，cf DNA的擴增失敗率較高65.2%，擴增成功的樣本與PGT-A符合率為37.5%。因此，在目前的技術條件下，培養液cf DNA的檢測結果應用于臨床還需要進一步完善。

囊胚培養液中cf DNA來源與組成成份十分復雜，這也是目前cf DNA檢測結果不能廣泛應用于臨床的主要原因之一。培養液cf DNA可能來源于囊胚滋養層細胞，可能來源于囊胚內細胞團細胞，也可能來源于卵裂球細胞，甚至還可能來源于包繞卵母細胞的顆粒細胞。如果cf DNA中來自于顆粒細胞的比例過大，就會導致cf DNA檢測結果不能反映胚胎的真實狀況，發生母源污染引起誤診。許多學者的研究已經注意到母源污染的存在以及對診斷結果準確性的影響[11-12]。因此，囊胚培養液的采集方法對cf DNA檢測結果至關重要。對于該技術的準確性與否，通常與臨床上廣為應用的PGT-A檢測結果做參考進行比較。臨床上PGT囊胚活檢主要有兩大類不同方法，包括D3打孔、囊胚形成疝再行活檢以及D3不打孔、囊胚期活檢前或者活檢同時再進行打孔。因此，本研究針對PGT周期，分別采用了三種不同的囊胚培養液的采集方法，背靠背比較了cf DNA與相應囊胚滋養層細胞的結果。在第一階段，胚胎D3天打孔，由于胚胎中含有碎片，打孔后會有碎片釋放到培養液中；因此，雖然第一階段的cf DNA檢出率較高(94.0%)，但是倍性符合率僅為55.0%。第二階段中，為了減少漏出的胚胎碎片對cf DNA檢測準確性的影響，胚胎D3天打孔，D4天再轉入另一新的培養液，收集D4～D5/D6的培養液；倍體符合率高于第一階段(69.2% vs 55.0%)，特別是非整倍體符合率為100%。第三階段中，胚胎不做打孔處理，D3再次去除顆粒細胞,D4轉入另一新的培養液，收集D4～D5/D6的培養液。cf DNA檢出率為86.0%，倍性符合率為76.7%。隨著采樣方法的逐步優化，倍性符合率逐漸增加，污染率也逐漸下降(9.3%、7.7%、2.3%)。本研究發現，在卵裂期再次去除顆粒細胞、收集D4到D5/D6的囊胚培養液，是一種較理想的NiPGT-A檢測的采樣方法。

眾所周知，囊胚的內細胞團細胞是未來發育成胎兒的部分，而滋養層細胞是胎盤和胎膜的起源。目前，臨床PGT周期采用的是滋養層細胞活檢，由于胚胎存在嵌合現象，有時候PGT結果并不能反映胚胎真實的整體狀況。那么，培養液中cf DNA是包含內細胞團、滋養層等細胞釋放的DNA混合體，會不會更好地反映胚胎的真實情況？Huang等[13]針對PGT周期捐贈的胚胎進行研究，研究人員將胚胎解凍后單獨培養，檢測培養液cf DNA、整個胚胎的整倍性，并且與之前的PGT滋養層細胞檢測結果作比較。Huang等[13]研究結果提示，cf DNA檢測能更好地代表胚胎整體狀況，檢測的特異性(80.0% vs 50.0%)和整倍體符合率(83.3% vs 62.0%)均優于PGT的滋養層細胞檢測。但是，也有學者提出[14]，囊胚期的胚胎具有自我修復能力，而且培養液中的cf DNA主要是來自內細胞團還是滋養層細胞尚不清楚。因此，cf DNA檢測是否能更好地反映胚胎狀況還需要進一步研究。

本研究發現了一個有趣的結果，移植的胚胎中，7枚NiPGT-A擴增失敗沒有結果的胚胎，5枚獲得臨床妊娠(71.4%)。這可能是由于胚胎質量好，凋亡的細胞少，培養液中cf DNA含量少的緣故所致。這也提示在臨床應用中，NiPGT-A無檢測結果的胚胎還應該慎重評價。

對于NiPGT-A是否能夠應用于臨床，引起了生殖領域的廣泛關注。目前，已經有一些學者開展了臨床研究。Rubio等[15]在4大洲的8個生殖中心開展了一項分析NiPGT-A與PGT-A結果一致性的研究，研究的中期(1/3結點)分析結果顯示，結果一致性為78.2%(62.1%～85.7%)，且不同的取卵方案、培養條件、胚胎質量不影響NiPGT-A結果的準確性。

囊胚培養液中的cf DNA雖然含量少，成份來源復雜，但是能夠提供胚胎的內在信息，并且對胚胎是一種無創方法。因此，眾多學者正在探索其在臨床應用的可行性及有效性。本研究通過優化采樣方法，提高cf DNA的檢測效率和準確性，推薦D3天再次去除顆粒細胞，采集D4～D5/6天囊胚培養液，而且不針對胚胎進行打孔處理。本研究提出了采樣方法對Ni-PGT檢測結果準確性的重要意義，為將來該技術在臨床應用提供可行性參考。