參松養心膠囊微生物限度檢查方法研究

武 玲 曹魯娜 任穎慧 趙蕊蕊

參松養心膠囊收載于《中華人民共和國藥典》2020年版一部，由人參、麥冬、山茱萸、桑寄生、土鱉蟲、赤芍、黃連等中藥經現代制藥工藝制成，具有益氣養陰，活血通絡，清心安神之功效[1]。有研究按照《中華人民共和國藥典》2005年版和2010年版要求開展參松養心膠囊的方法驗證，發現該樣品有明顯抑菌活性[2-3]。自《中華人民共和國藥典》2015年版起微生物計數方法在培養體系、檢測方法等方面做了較大修訂[4]，本研究按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1105、1106和1107要求，通過檢索文獻[5-7]，結合微生物限度標準和企業提 供的資料，選定敏感菌株，采用3批樣品開展獨立平行試驗，從平皿法最低稀釋級開始進行預試驗，采用增加稀釋倍數、使用中和劑等設計方法適用性試驗?，F報道如下。

1 儀器及試藥

1.1 儀器設備

BSC-1300ⅡA2生物安全柜；JE1201電子天平；DNP-9162BS-Ⅱ電熱恒溫培養箱；BPH-9272精密恒溫培養箱；MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌器等。

1.2 供試品

參松養心膠囊，北京以嶺藥業有限公司，批號2101017、2102023、2104009。

1.3 菌種

金黃色葡萄球菌[Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003]，白色念珠菌[Candida albicans，CMCC（F）98001]，枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis，CMCC（B）63501]，大腸埃希菌[Escherichia coli，CMCC（B）44102]，銅綠假單胞菌[Pseudomonas aeruginosa，CMCC（B）10104]，黑曲霉[Aspergillus niger，CMCC（F）98003]，乙型副傷寒沙門菌[Salmonella paratyphi B，CMCC（B）50094]，均來源于廣東環凱微生物科技有限公司，經本實驗室復蘇傳代并鑒定合格，本試驗所用菌種均為第4代。

1.4 培養基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）、沙氏葡萄糖液體培養基（SDB）、腸道菌增菌液體培養基（EE）、紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基、麥康凱液體培養基、麥康凱瓊脂培養基、RV沙門菌增菌液體培養基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基、三糖鐵瓊脂培養基。氯化鈉、聚山梨酯80由國藥集團化學試劑有限公司提供；培養基經過適用性檢查，符合標準要求。

2 方法與結果

2.1 供試液制備

2.1.1 平皿傾注法 取1.2項下供試品10 g，加入TSB至100 ml，混勻，制成1∶10的供試液。取1∶10的供試液適量，加入TSB依法制成1∶50、1∶100的不同稀釋濃度供試液[8]。

2.1.2 中和法 取1.2項下供試品10 g，加入含7 g/L聚山梨酯80的TSB至100 ml，混勻，制成1∶10的供試液。取上述供試液適量，加入含7 g/L聚山梨酯80的TSB依法制成1∶50、1∶100的供試液[8]。

2.2 菌液制備

按照《中華人民共和國藥典》2020版四部[9]通則1105的要求，制備成每毫升菌落數為5 000～10 000 cfu的試驗菌液。

2.3 計算與結果判斷

2.3.1 計算公式

2.3.2 結果判斷 計數方法適用性試驗中，采用平皿法時，各試驗菌回收比值應在0.5～2范圍內；使用中和劑時，應確認其有效性和對微生物無毒性，中和劑對照組回收比值應在0.5～2范圍內；3次獨立、平行試驗中，若出現任一回收比值小于0.5，應采用適宜方法重新進行方法適用性試驗?？刂凭鷻z查適用性試驗陽性對照組應檢出試驗菌，陰性對照組應無菌落生長[9]。

2.4 需氧菌總數預試驗（選取敏感菌株）、霉菌和酵母菌總數

2.4.1 平皿傾注法 試驗組1：取2.1.1項下1∶10供試液9.9 ml置入無菌試管，加入2.2項下枯草芽孢桿菌懸液0.1 ml，使每毫升供試液中含菌量不大于100 cfu，混勻，取上述溶液1 ml注入平皿，平行制備2個平皿。同法制備1∶50、1∶100的試驗組，作為需氧菌總數敏感菌株預試驗用。

試驗組2：取2.1.1項下1∶10供試液9.9 ml置入無菌試管，分別加入2.2項下白色念珠菌和黑曲霉菌懸液各0.1 ml，其他操作同試驗組1，作為霉菌和酵母菌總數計數試驗用。

供試品對照組：取2.1.1項下供試液9.9 ml置入無菌試管，以稀釋液代替試驗菌液，其他操作同試驗組1。

菌液對照組：取稀釋液9.9 ml置入無菌試管，分別加入2.2項下枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌懸液各0.1 ml，其他操作同試驗組1，作為上述3種菌株的回收試驗用。

上述各組平皿，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部[9]要求，注入15～20 ml溫度不超過45 ℃相對應的SDA或TSA，測定各平皿菌落數，計算3次獨立試驗的平均回收比值。見表1。

由表1數據可知，在需氧菌總數計數中以枯草芽孢桿菌作為敏感菌株，采用平皿傾注法（1∶100）時，回收比值仍小于0.5，表明參松養心膠囊對枯草芽孢桿菌有很強的抑制作用；采用平皿傾注法（1∶10）時，霉菌和酵母菌總數計數的試驗菌回收比值均在0.5～2范圍內，表明該方法有效。

表1 需氧菌總數預試驗、霉菌和酵母菌總數回收比值（平皿傾注法）

2.4.2 需氧菌總數計數預試驗（中和法） 分別取2.1.2項下1∶10、1∶50、1∶100供試液9.9 ml，稀釋劑用含7 g/L聚山梨酯80的TSB代替TSB，加入2.2項下枯草芽孢桿菌懸液，其他操作同2.4.1步驟，制備試驗組、供試品組和菌液對照組。

中和劑對照組：取含7 g/L聚山梨酯80的TSB 9.9 ml置入無菌試管，加入2.2項下枯草芽孢桿菌懸液，其他操作同2.4.1步驟，進行中和劑的菌種回收試驗。

以上各組平皿，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部[9]要求注入15～20 ml溫度不超過45 ℃ TSA培養基，測定各平皿菌落數，計算3次獨立試驗的平均回收比值，結果供試液（1∶10、1∶50）加入中和劑時，枯草芽孢桿菌回收比值仍小于0.5，供試液（1∶100）加入中和劑時，回收比值在0.5～2范圍內。

2.4.3 需氧菌總數計數正式試驗 取2.1.2項下1∶100供試液9.9 ml 5份，分別加入2.2項下金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉5種試驗菌液各0.1 ml，其他操作同2.4.2項下預試驗操作制備各組平皿。按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部[9]要求注入15～20 ml溫度不超過45 ℃的TSA培養基，測定各平皿菌落數，計算3次獨立試驗的平均回收比值。

2.4.4 試驗結果 中和劑對照組菌種回收比值均在0.5～2范圍內，表明含7 g/L聚山梨酯80的TSB對試驗菌株無抑菌性且無損傷[10]。參松養心膠囊采用1∶100稀釋中和法進行需氧菌總數計數方法適用性試驗時，試驗菌種的回收比值均在0.5～2范圍內，表明方法可行。見表2。

表2 需氧菌總數計數適用性試驗回收比值（1∶100中和法）

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗

2.5.1 大腸埃希菌 陽性對照組：取2.1.1項下1∶10供試液10 ml和不大于100 cfu的大腸埃希菌懸液，接種至100 ml TSB中，混勻，33 ℃培養 24 h。供試品組：取1∶10供試液10 ml，不加菌液，其他同陽性對照組。

2.5.2 耐膽鹽革蘭陰性菌 預培養：取2.1.1項下1∶10供試液，在23 ℃預培養2 h，備用。陽性對照組：分別取相當于0.1 g、0.01 g和0.001 g的預培養物各2份，1份加入銅綠假單胞桿菌懸液（不大于100 cfu），1份加入大腸埃希菌懸液（不大于100 cfu），接種至10 ml EE中，33 ℃培養48 h。供試品組：取預培養物1 ml，不加菌懸液，其他同陽性對照組。

2.5.3 沙門菌 陽性對照組：取2.1.1項下供試品10 g和不大于100 cfu的乙型副傷寒沙門菌懸液，接種至100 ml TSB中，混勻，33 ℃培養24 h。供試品組：取供試品10 g，不加菌懸液，其他同陽性對照組。

以上各組取稀釋劑代替供試液，其他同供試品組操作，分別制備陰性對照組。上述各組控制菌的培養物，按照《中華人民共和國藥典》2020年版四部[9]規定進一步選擇和分離培養，如果陽性對照組無菌落生長，表明參松養心膠囊對該菌有抑制作用，則采用增加培養基的方法，重復上述試驗。

2.5.4 試驗結果 按照常規培養基體積檢查時，陰性對照組均無菌落生長，大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌均檢出試驗菌，沙門菌陽性對照組未檢出試驗菌。表明該樣品對沙門菌有抑菌活性，將稀釋液增加至200 ml時，陽性對照組菌落生長良好。見表3。

表3 控制菌方法適用性試驗結果

3 討論

藥品微生物限度檢查是保證用藥的有效性、保障藥品安全性的重要措施[11]。進行微生物限度檢查時，首先采用平皿傾注法低稀釋倍數進行方法學初篩，對有抑菌活性的樣品，采用適宜的方法去除其抑菌活性并進行方法適用性試驗才能確保檢驗結果的科學性和準確性[12]。

在開展方法試用性工作中以及查閱文獻[6,13-15]發現，樣品對某種試驗菌有抑菌活性的較多，對5種試驗菌株均有抑菌活性的較為罕見，而且對需氧菌總數計數試驗菌株表現出抑菌活性的居多。因此本研究進行試驗設計時，經過綜合分析，選定枯草芽孢桿菌作為敏感菌株進行需氧菌總數方法適用性預試驗，減少了試驗菌液使用量和檢驗時的工作量，降低了試驗過程中引入微生物污染的風險，提高了工作效率，可為其他實驗室提供借鑒。

方法適用性試驗的本質是建立對樣品影響更小、操作效率更高的方法[16]。2.4項下預試驗的結果表明參松養心膠囊對敏感菌株枯草芽孢桿菌有較強的抑制作用，采用平皿傾注法（1∶100）時3批樣品對枯草芽孢桿菌的回收比值均小于0.5，不宜繼續采用增加稀釋濃度的方法。在去除樣品抑菌活性時，薄膜過濾法較為常用，但本品供試液含不溶性顆粒較多，難以過濾，很難通過薄膜過濾法消除抑菌成分[6]。同時薄膜過濾法操作較為繁瑣，容易染菌[5]，適宜的中和劑能較好地去除樣品抑菌活性，且操作簡便，工作效率高。聚山梨酯80是一種非離子表面活性劑，可增加藥品溶解度[17-20]，對微生物有一定保護作用[21]，因此本研究使用聚山梨酯80作為中和劑。

通過試驗，建立了參松養心膠囊的微生物限度檢查方法：需氧菌總數計數采用1∶100稀釋中和法；霉菌和酵母菌總數計數采用平皿傾注法（1∶10）；大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌檢查采用常規培養基體積，沙門菌采用培養基稀釋法。該方法操作簡便，能真實地反映樣品實際污染微生物情況，可為藥品生產企業和檢驗機構提供參考。