駐景丸加減方對形覺剝奪性近視小鼠視網膜自噬的影響

馬 捷，莫 亞，2，葉映含，龍丹寧，鄧睎遠

0 引言

近年來，近視的患病率在全球范圍內呈爆發性增長且逐漸呈低齡化發展趨勢，由近視引起的近視視網膜退變也隨之上升[1]，是青年患者首要致盲性眼病。雖然近視形成的確切機制尚不明確，但已有研究指出近視形成過程與炎癥、氧化反應等密切相關[2]。視網膜中含有大量線粒體，是活性氧(reactive oxygen species,ROS)的重要來源，ROS積累過多可造成蛋白質和不飽和脂肪酸的氧化，從而損傷機體組織。研究表明減少ROS的產生可防止視網膜病變[3]，ROS過多增加則會誘導細胞凋亡和自噬[4]。自噬是一種基本的分解代謝機制，主要通過溶酶體降解細胞內受損細胞器及下調ROS、炎癥小體等[5]，維持細胞內穩態[6]。LC3Ⅱ的量與自噬小體數量密切相關，可作為觀察細胞自噬活性的關鍵指標，p62作為自噬受體蛋白，是反映自噬活性的輔助指標。小膠質細胞是中樞神經系統重要的免疫細胞之一，神經系統發育早期，可快速清除凋亡的軸突，并啟動程序性死亡調控神經元的數量。研究發現當機體受到刺激時，小膠質細胞將發生活化與遷移[7]。活化的小膠質細胞將產生對神經元有害的ROS、分泌炎癥因子誘導炎癥反應，導致細胞內環境穩態失衡[8]。研究發現自噬與小膠質細胞聯系緊密，可調控小膠質細胞活化介導的炎癥反應[9-10]。近視，在古籍中被稱之為“目不能遠視”“能近怯遠癥”?！秾徱暚幒酚涊d本病為“肝經不足腎經病，光華咫尺視模糊”及“陽不足，病于少火者也”，認為近視之病，多因肝腎不足所致。駐景丸加減方，最早源于倪德維的《原機啟微》，現臨床使用多出自陳達夫[11]《中醫眼科六經法要》，方中主要含有菟絲子、枸杞子、楮實子、五味子、茺蔚子、三七等，具有肝腎同補、活血明目的作用。研究發現駐景丸加減方可激活抗氧化系統與自噬系統，對近視發展過程中出現的視網膜病變、視神經退行性病變具有保護作用[12-13]。研究表明視網膜病變、視神經退行性病變與小膠質細胞活化有關[14-15]。綜上,本研究通過建立形覺剝奪性近視(FDM)小鼠模型，探究駐景丸加減方是否通過調控自噬，達到干預近視及近視視網膜退變的目的。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1動物3周齡SPF級C57BL/6小鼠30只，體質量18±2g，許可證號：SYXK(川)2019-049，檢查小鼠健康無眼病及皮膚破損，保持實驗室光照12h/d，飼養于(22±2)℃的環境中，自由攝食和飲水。本研究通過成都中醫藥大學動物實驗倫理審查審批(備案編號：2002-22)。

1.1.2主要試劑與藥品IBa1，小鼠克隆抗體(批號：GB12105，Servicebio)；LC3Ⅱ抗體，兔克隆抗體(貨號：A19665，abclonal)；p62抗體，兔克隆抗體[貨號：ab109012，英國abcam-艾博抗(上海)貿易有限公司]；IBa1抗體，小鼠克隆抗體(批號：GB12105，Servicebio)；RNA Trizol Reagent(批號：vs18061730，合肥博美生物科技有限公司)；駐景丸加減方采用該方制成的我院院內制劑補精益視片，每片0.3g(批號：20200703，成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科)，主要成分為：楮實子、菟絲子、茺蔚子、五味子、枸杞子、三七等。

1.1.3儀器帶狀檢影鏡(六六視覺醫療器械有限公司)；A超(KN-1800)；顯微手術器械(宿遷奕菲電子商務有限公司)；手術顯微鏡(合肥密維光學儀器有限公司)；化學發光凝膠成像儀5200(上海天能科技有限公司)；圖像分析軟件Image-J(美國National Institutes of Health)；透射電子顯微鏡：型號JEM-1400FLASH(日本電子JEOL)；實時熒光定量(RT-PCR)儀：型號PIKORed 96(美國ThermoFisher儀器有限公司)；萊卡組織處理機：EM TP，(德國萊卡)；玻璃制刀機：EM KMR3(德國萊卡)。

1.2方法

1.2.1分組與造模小鼠30只隨機分為陰性對照組、近視模型組、中藥干預組，每組10只。陰性對照組雙眼不做任何處理，剩余兩組使用半透明眼罩遮蓋右眼使其形成FDM模型，左眼不做任何處理。

1.2.2治療方法陰性對照組與近視模型組灌胃生理鹽水0.15mL/d，中藥干預組灌胃駐景丸加減方混懸液0.546g/(kg·d)(0.15mL/d)，連續灌胃4wk。

1.2.3屈光度與眼軸長度檢測分別于實驗開始時、實驗結束時測量所有小鼠右眼屈光度、眼軸長度。所有小鼠使用托吡卡胺散瞳，共4次，每次間隔5min，4次后間隔20min，散瞳完成后由1名有經驗的驗光師使用帶狀檢影鏡，對小鼠右眼驗光,每只小鼠驗光3次，取平均值。固定小鼠后，使用鹽酸丙美卡因滴其右眼結膜囊，后使用眼部A超測量小鼠右眼眼軸長度，測量5次，取其平均值。

1.2.4免疫熒光法定位和檢測Iba1 實驗結束時，每組隨機選3只小鼠使用過量麻醉[10%水合氯醛溶液(350mg/kg)]處死小鼠，在手術顯微鏡下完整摘除所選小鼠右眼眼球，并將其放入4%多聚甲醛固定液中固定2h，梯度乙醇、二甲苯脫水，浸蠟包埋，制備視網膜切片；將脫蠟后的切片浸入0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)，微波爐中高火加熱至沸騰后斷電，間隔5min后，反復1次，冷卻，分別加入濃度1∶100 Iba1一抗，4℃下過夜后水沖洗3次；加入二抗，按常規步驟進行，通過熒光掃描顯微鏡攝像系統對切片進行圖像采集，每張切片先低倍鏡下觀察后，分別選取3個視野采集400倍顯微圖像。

1.2.5透射電鏡實驗4wk時，小鼠右眼視網膜取材與固定方法同“1.2.4”項，各組選用1只小鼠右眼視網膜，通過丙酮逐級脫水，滲透與包埋，制成超薄切片(50nm)，經醋酸鈾和鉛鹽染色后使用JEM-1400FLASH透射電鏡觀察、進行圖像采集。

1.2.6WesternBlot檢測視網膜組織LC3Ⅱ和p62表達實驗結束時，各組取3只小鼠右眼視網膜搖勻吸出上清液并測蛋白水平，分別放入β-actin(內參蛋白)、LC3Ⅱ、p62一抗，濃度分別對應1∶100000、1∶1000、1∶5000，常規孵育過夜，PVDF膜洗3次，放入濃度1∶5000二抗，重復沖洗，顯色凝膠成像系統掃描觀察，最后使用天能GIS機箱控制軟件V2.0對條帶進行曝光掃描，目標蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值比值為相應蛋白表達結果。

1.2.7q-PCR檢測視網膜組織LC3Ⅱ和p62mRNA表達實驗結束時，各組取3只小鼠右眼視網膜，提取總RNA，逆轉錄為cDNA，采用q-PCR技術檢測LC3Ⅱ、p62 mRNA表達水平，以β-actin為內參基因。使用Primer Premier引物設計軟件設計篩選各基因特異性引物。所有引物均交由上海生物工程技術服務有限公司設計合成，見表1。采用2-ΔΔCt法對各組小鼠眼球中的LC3Ⅱ、p62 mRNA相對表達水平進行定量分析。

表1 本次檢測所用引物及堿基序列

2 結果

2.1屈光度與眼軸長度屈光度變化見表2，圖1A，眼軸長度變化見表3，圖1B。實驗開始，三組小鼠屈光度差異無統計學意義(P>0.05)；實驗結束時屈光度結果示，與陰性對照組比較，中藥干預組、近視模型組屈光度降低(均P<0.01)，近視模型組、中藥干預組造模眼形成相對近視。實驗開始，3組小鼠眼軸長度差異無統計學意義(P>0.05)；實驗結束時眼軸長度結果示，近視模型組、中藥干預組眼軸長度較陰性對照組眼軸長度顯著增加(均P<0.01)，且近視模型組眼軸長度較中藥干預組眼軸長度有增加趨勢。

圖1 各組小鼠檢測指標匯總 A：小鼠屈光度；B：小鼠眼軸長度；C：免疫熒光法檢測視網膜組織中Iba1平均熒光強度；D：Western Blot法檢測視網膜組織中LC3Ⅱ及p62蛋白相對表達水平；E：q-PCR法測定視網膜組織中LC3Ⅱ、p62 mRNA相對表達水平；F：LC3Ⅱ、p62、β-actin蛋白條帶。aP<0.05,bP<0.01 vs 陰性對照組；cP<0.05 vs 近視模型組。

表2 各組小鼠屈光度的變化

表3 各組小鼠眼軸長度的變化

2.2免疫熒光法定位和檢測Iba1結果實驗結束時Iba1標記小膠質細胞觀察到：陰性對照組少量靜息狀態Iba1陽性表達位于視網膜外叢狀層與內叢狀層，近視模型組、中藥干預組主要位于外叢狀層、內叢狀層與神經節細胞層，近視模型組、中藥干預組Iba1向神經節細胞層遷移，見圖2。Iba1通過平均光密度計算，實驗結束時結果示，近視模型組Iba1蛋白含量(29.6087±0.4998)表達最強，陰性對照組(25.2637±2.7394)次之，中藥干預組(24.4810±1.8684)最少，三組差異有統計學意義(F=6.107，P=0.036)；與陰性對照組比較，近視模型組Iba1蛋白含量增加(P<0.05)；與近視模型組比較，中藥干預組Iba1蛋白含量降低(P<0.05)，見圖1C。

圖2 各組小鼠視網膜免疫熒光定位Iba1結果 A：陰性對照組；B：近視模型組；C：中藥干預組。Iba1為紅色點狀染色。GCL:神經節細胞層；INP：內叢狀層；INL:內核層；ONP：外叢狀層；ONL：外核層。

2.3透射電鏡觀察各組小鼠自噬形態學表征透射電鏡觀察見圖3，實驗結束時陰性對照組小鼠視網膜色素上皮細胞超微結構未見明顯病變；近視模型組視網膜色素上皮細胞胞漿內見少量自噬小體，但線粒體等細胞器無明顯異常；中藥干預組小鼠視網膜色素上皮細胞超微結構較正常，見少量自噬小體，且細胞器結構完整。

圖3 透射電鏡觀察各組小鼠視網膜色素上皮細胞超微結構 A：陰性對照組；B：近視模型組；C：中藥干預組。細胞核(N)、線粒體(Mi)、粗面內質網(RER)、色素顆粒(↑)、自噬的色素細胞(↑)。

2.4WesternBlot法檢測視網膜組織中LC3Ⅱ及p62表達LC3Ⅱ、p62蛋白表達結果顯示，實驗結束時，與近視模型組比較，中藥干預組LC3Ⅱ及p62表達具有明顯增加趨勢，陰性對照組有遞減趨勢(P>0.05，圖1D，表4)，蛋白條帶見圖1F。

表4 實驗結束時各組小鼠視網膜組織中LC3Ⅱ、p62蛋白表達

2.5q-PCR檢測視網膜組織LC3Ⅱ及p62mRNA表達實驗結束時q-PCR結果見圖1E，表5。與陰性對照組相比，近視模型組小鼠眼球視網膜組織中LC3Ⅱ mRNA表達升高(P<0.05)；與近視模型組相比，中藥干預組小鼠眼球視網膜組織中LC3Ⅱ mRNA表達升高(P<0.05)。與陰性對照組相比，近視模型組小鼠眼球視網膜組織中p62 mRNA具有升高趨勢(P>0.05)；與近視模型組相比，中藥干預組小鼠眼球視網膜組織中p62 mRNA有升高趨勢(P>0.05)。

表5 實驗結束時各組小鼠視網膜組織中LC3Ⅱ、p62 mRNA的表達

3 討論

近年來，近視發病率呈爆發性增長，將給患者、社會帶來極大的經濟負擔[15]，雖然近視的發病機制尚不明確，但多數學者認為近視發生發展受環境、遺傳以及種族因素共同影響[16]。近視的發展與炎癥因子、腫瘤壞死因子、ROS累積密切相關，近視持續發展將造成視網膜退變，例如視網膜色素上皮層功能障礙、視網膜厚度、氧供、血管、微循環及神經節細胞層等異常[17-19]，將增加近視患者視力障礙及失明的風險[20]。因此應積極尋找有效干預近視所致視網膜退變的方法。

由于FDM小鼠被廣泛用于近視研究中[21]，本研究采用遮蓋3周齡C57BL/6J小鼠右眼的方法制成FDM動物模型。小鼠視力發育呈生理化遠視發展[22]，因此我們用測量結果“相對近視化”即屈光度降低來評判近視造模是否成功。本實驗研究結果示，實驗結束時與陰性對照組比較，近視模型組、中藥干預組屈光度降低(P<0.01)，向近視方向漂移，形成相對近視，與李欣蒙等[23]FDM造模結果一致，表明近視造模成功。實驗結束時與陰性對照組比較，近視模型組及中藥干預組眼軸長度顯著增加，與本課題組前期實驗通過使用半透明眼罩遮蓋小鼠右眼，誘導小鼠眼軸增加、視網膜厚度改變結果相一致[24]，結合屈光度向近視方向漂移，表明軸性近視造模成功。

本課題組前期研究發現，近視發展過程中，通過調節自噬，可延緩近視進一步發展[13]，然而其具體機制尚不明確。研究發現壓力刺激下，可通過啟動自噬以維持細胞穩態、適應不利環境[25]。近視視網膜疾病中，自噬具有促進視網膜細胞的存活與死亡的雙重作用：正常水平的自噬可誘導視網膜細胞在有害壓力環境下防御能力增加，自噬過多可能會誘導視網膜受損[26]。小膠質細胞作為免疫細胞，正常機制下可調節內環境穩態。Lennikov等[27]發現小膠質細胞受到炎癥因子、腫瘤壞死因子等刺激時可促進其活化、遷移，并導致視網膜病變。另外研究指出視網膜缺氧時，活化的小膠質細胞促進視網膜新生血管生成與血管病變[28]，加速視網膜神經節細胞凋亡[29]。Dang等[30]發現增強自噬，可有效抑制小膠質細胞活化引起的炎癥反應與氧化反應。

本實驗干預藥物使用源于駐景丸加減方制成的我院院內制劑補精益視片，前期研究發現該方可恢復感光細胞自噬，抑制感光細胞凋亡，促進視網膜的修復等作用[31]。方中含有枸杞子、菟絲子、楮實子、五味子、茺蔚子、三七等，全方配伍起到“肝腎同補、活血明目”的作用?，F代藥理學研究發現菟絲子[32]、枸杞子[33]、五味子[34]、楮實子[35]具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等作用；三七[36]可以減少細胞凋亡和增強自噬，具有抗凋亡作用、改善缺血灌注的作用。綜上所述，駐景丸加減方具有調節視網膜自噬、抗炎抗氧化、改善微循環的功能。

本實驗研究結果示，實驗結束時與陰性對照組比較，近視模型組Iba1表達顯著增加并向神經節細胞層遷移(P<0.05)，表明近視形成過程中,近視模型組小膠質細胞活化并發生遷移。近視的發生發展與炎癥、ROS積累過多相關[2]，而炎癥因子與ROS積累過多將導致小膠質細胞活化[37]，研究發現活化的小膠質細胞將再次釋放炎癥細胞因子及ROS,進一步加重光感受器細胞受損[38]。光感受器細胞受損，具有增加小鼠視網膜病變的風險[39]。研究發現視網膜色素上皮細胞具有吞噬脫落光感受器細胞外節盤膜、防止受損光感受器細胞的作用，在維持光感受器正常功能方面具有重要意義[40]，故本實驗通過透射電鏡觀察小鼠視網膜色素上皮層細胞自噬情況。q-PCR結果示，與陰性對照組比較，近視模型組LC3Ⅱ mRNA顯著增加(P<0.05)，p62 mRNA、LC3Ⅱ與p62蛋白表達有增加趨勢，結合透射電鏡結果，表明近視模型組自噬激活。研究表明增強自噬可抑制炎癥反應與氧化反應[41]，故推測近視模型組自噬的發生可能與抑制近視發展過程中出現的炎癥反應、氧化反應相關。

實驗結束時，與近視模型組比較，中藥干預組LC3ⅡmRNA相對表達水平顯著增加(P<0.05)，p62 mRNA、LC3Ⅱ與p62蛋白表達有增加趨勢，結合透射電鏡結果，表明中藥干預組視網膜自噬增強；此外中藥干預組屈光度向近視漂移相對減少(P<0.05)，Iba1表達顯著降低(P<0.05)，提示駐景丸加減方對抑制相對近視發展、小膠質細胞活化均有一定的干預作用。小膠質細胞活化可造成視網膜新生血管生成與血管病變[27]，研究發現三七[42]、枸杞[43]、五味子[44]可通過促進自噬并抑制細胞凋亡改善機體缺血，故推測中藥干預組干預近視發展的同時，通過抗炎抗氧化、改善微循環等抑制小膠質細胞活化，并起到增強視網膜自噬的作用。

綜上所述，本研究發現駐景丸加減方可通過抑制小膠質細胞活化,增強視網膜自噬以達到干預近視進一步發展和保護視網膜的目的，為駐景丸加減方在近視干預中提供理論依據。