二代測(cè)序技術(shù)在膿毒癥病原學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值

查渝，曹曉光，戴媛媛，黃羽，王春艷，周樹(shù)生

中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院),a 急救中心ICU,b 細(xì)菌室,合肥 230001

膿毒癥是重癥醫(yī)學(xué)科(ICU)最常見(jiàn)的病癥，是導(dǎo)致重癥患者死亡的主要原因之一[1]。近年來(lái)，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。膿毒癥治療的核心環(huán)節(jié)是病原體的早期識(shí)別和有效抗菌藥物的盡早應(yīng)用[3-6]。目前病原學(xué)診斷方法常用的有細(xì)菌培養(yǎng)和病原體遺傳物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)[包括基因探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)]，在特異性、敏感性和診斷時(shí)間等方面各有優(yōu)勢(shì)。二代測(cè)序技術(shù)(NGS)可同時(shí)針對(duì)上百萬(wàn)個(gè)核酸片段進(jìn)行檢測(cè)，可快速、準(zhǔn)確檢測(cè)出樣本中所有病原體尤其是非典型、罕見(jiàn)病原體等[7-8]。由于缺乏公認(rèn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致其在臨床運(yùn)用上存在認(rèn)識(shí)差異。本研究分析了2018年1月至2022年1月某三級(jí)甲等教學(xué)醫(yī)院收治82例疑似膿毒癥患者，并將NGS與血培養(yǎng)和PCR等檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)一步明確NGS臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2018年1月至2022年1月某三級(jí)甲等教學(xué)醫(yī)院收治住院的82例疑似膿毒癥患者臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)血細(xì)菌培養(yǎng)、NGS結(jié)果考慮為標(biāo)本污染和數(shù)據(jù)嚴(yán)重缺失患者；(2)所有病原體檢測(cè)結(jié)果的解讀均由3名ICU高級(jí)職稱醫(yī)師共同商議后決定，意見(jiàn)不統(tǒng)一的病例。檢測(cè)時(shí)間為標(biāo)本送檢至出具報(bào)告所需時(shí)間。

1.2 膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)及病原體判定 膿毒癥診斷根據(jù)Sepsis 3.0標(biāo)準(zhǔn)，初始入組標(biāo)準(zhǔn)為發(fā)熱伴有快速序貫臟器衰竭評(píng)分(qSOFA)≥2分，最終診斷標(biāo)準(zhǔn)為感染+序貫臟器衰竭評(píng)分(SOFA)≥2分[9]。病原體的判定參照《中國(guó)宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)感染病原體的臨床運(yùn)用專家共識(shí)(2020)》[10]推薦意見(jiàn)，結(jié)合患者血細(xì)菌培養(yǎng)、PCR檢測(cè)、臨床表現(xiàn)及輔助檢查結(jié)果，由3名ICU高級(jí)職稱醫(yī)師共同商議后確認(rèn)致病病原體。

1.3 儀器與試劑 全自動(dòng)血培養(yǎng)儀及配套血培養(yǎng)瓶(美國(guó)BD公司)，VITEK-32全自動(dòng)微生物分析儀及配套鑒定藥敏卡VITEK MSTM 質(zhì)譜儀(法國(guó)VITEK公司)，GTQ-Cycler擴(kuò)增儀(德國(guó)海恩公司)，DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)，ABI7500 熒光定量PCR儀(北京六一儀器廠)，GIS凝膠圖像分析儀(上海天能公司)。二代測(cè)序及生物信息學(xué)分析由華大基因研究所完成。PCR引物序列：HSV(武漢百泰)、EBV和CMV(達(dá)安基因)。

1.4 血培養(yǎng)及PCR檢測(cè) 血培養(yǎng)的采集參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的血培養(yǎng)臨床實(shí)踐指南。對(duì)疑似膿毒癥的患者，從不同穿刺位點(diǎn)平均采集2套標(biāo)本進(jìn)行血培養(yǎng)，采集的血液被立即注入需氧瓶和厭氧瓶(每瓶8～10 mL血液)。血培養(yǎng)瓶用全自動(dòng)血培養(yǎng)儀培養(yǎng)5 d，對(duì)培養(yǎng)陽(yáng)性的標(biāo)本及時(shí)轉(zhuǎn)種到哥倫比亞血平板、巧克力平板及麥康凱平板。培養(yǎng)出的微生物使用VITEK-32全自動(dòng)藥敏分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。PCR檢測(cè)病原體：將血標(biāo)本離心后，取0.5～1 mL血漿加入50 μL DNA提取液混勻，100 ℃水浴10 min后離心，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)置PCR反應(yīng)條件。

1.5 NGS檢測(cè)

1.5.1 樣本處理和核酸提取 取1～2 mL新鮮血液標(biāo)本，經(jīng)玻璃珠混合震蕩后提取DNA標(biāo)本進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建。

1.5.2 文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序 采用Agilent 2100 Bioanalyzer 質(zhì)控文庫(kù)插入片段大小，采用Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher，美國(guó))質(zhì)控DNA文庫(kù)濃度，經(jīng)環(huán)化形成單鏈環(huán)形結(jié)構(gòu)。環(huán)化后的文庫(kù)經(jīng)滾環(huán)復(fù)制(RCA)生成DNB 納米球。制備好的DNB納米球加載到測(cè)序芯片，采用BGISEQ-500進(jìn)行測(cè)序。

1.5.3 數(shù)據(jù)分析 測(cè)序數(shù)據(jù)下機(jī)后去除低質(zhì)量的和長(zhǎng)度<35 bp的數(shù)據(jù)以獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，將高質(zhì)量數(shù)據(jù)中比對(duì)上人參考基因組序列的數(shù)據(jù)去除，剩下的數(shù)據(jù)去除低復(fù)雜度reads后與專用的微生物大數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，并將比對(duì)后的數(shù)據(jù)按照病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng)等進(jìn)行分類和排列。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，采用Mann-Whitney檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)及百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。使用MedCalc 18.11.3軟件，用Delong法繪制受試者工作特征(ROC)曲線計(jì)算靈敏度、特異度及曲線下面積(AUC)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 82例患者中，男性53例，女性29例；年齡14～96歲。所有患者均采用NGS和血培養(yǎng)檢測(cè)，32例患者采用PCR分子鑒定法。診斷為膿毒癥患者62例(膿毒癥組)，非膿毒癥患者20例(非膿毒癥組)。膿毒癥組NGS和血培養(yǎng)陽(yáng)性率均高于非膿毒癥組(NGS：80.65%比55.00%;血培養(yǎng)：19.35%比0)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)預(yù)后的影響，62例膿毒癥患者中35例(56.45%)未治愈，明顯高于非膿毒癥(25.00%)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；余指標(biāo)組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1、表2。

表1 膿毒癥組與非膿毒癥組相關(guān)資料比較

表2 疑似膿毒癥患者82例預(yù)后相關(guān)資料比較

2.2 血培養(yǎng)及PCR結(jié)果分析 82例患者血培養(yǎng)檢測(cè)時(shí)間為(5.61±1.22)d，共計(jì)12例患者陽(yáng)性，陽(yáng)性率14.63%，共計(jì)13種病原體，分別為：肺炎克雷伯桿菌3例、銅綠假單胞菌桿菌2例、大腸桿菌2例，鮑曼不動(dòng)桿菌、伯克霍爾德菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、溶血葡萄球菌各1例，白色假絲酵母1例。32例患者進(jìn)行了PCR檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間為(1.52±0.31)d，檢測(cè)結(jié)果為：巨細(xì)胞病毒(CMV)4例、人類皰疹病毒(EBV)5例。

2.3 NGS結(jié)果分析 82例NGS檢測(cè)結(jié)果中共有61例呈陽(yáng)性，陽(yáng)性率為74.39%；平均檢測(cè)時(shí)間為(1.32±0.26)d；其中，常見(jiàn)病原菌有金黃色葡萄球菌4例，肺炎克雷伯桿菌14例和鮑曼不動(dòng)桿菌10例；常見(jiàn)病毒為CMV 22例、EBV 13例和單純皰疹病毒1型(HSV-1)13例；真菌及其他病原體常見(jiàn)為耶氏肺孢子菌8例、煙曲霉5例、問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體3例和軍團(tuán)菌2例。

2.4 NGS與血培養(yǎng)、PCR結(jié)果之間的比較 對(duì)比NGS與血培養(yǎng)的檢測(cè)結(jié)果，其中35例結(jié)果完全一致，47例結(jié)果不完全一致；不完全一致結(jié)果主要包括病毒、真菌、衣原體、支原體以及其他病原體。82例患者中，45例患者NGS檢測(cè)出1種以上病原體，1例患者血培養(yǎng)檢測(cè)出2種病原體；NGS檢測(cè)出病原體陽(yáng)性率明顯高于血培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 不同方法檢測(cè)膿毒癥病原體結(jié)果比較[例(%)]

以膿毒癥臨床診斷為“金標(biāo)準(zhǔn)”，繪制ROC曲線，NGS和血培養(yǎng)AUC、靈敏度和特異度分別為0.628、80.6%、45.0%和0.597、19.4%、100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為82.0%、42.9%和100%、28.6%。PCR靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和AUC分別為36.4%、90.0%、88.9%、39.1%和0.632。

3 討論

膿毒癥是目前重癥患者的主要死亡原因之一[11]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥組患者有35例未治愈，占56.45%，明顯高于非膿毒癥組重癥患者的25.00%，這和相關(guān)研究結(jié)果[1-2,8,11]基本一致。膿毒癥患者合并多器官功能障礙，好發(fā)于高齡、有慢性基礎(chǔ)疾病的患者；此類患者病情進(jìn)展快，短時(shí)間內(nèi)難以獲知準(zhǔn)確的病原體常因抗感染治療方案不夠精準(zhǔn)等因素導(dǎo)致預(yù)后不良[12-13]，盡快獲得病原學(xué)診斷是目前臨床研究的難點(diǎn)。

在膿毒癥患者中，血培養(yǎng)是目前臨床醫(yī)生最常用的獲得病原體的方法，也是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)[9]。但在膿毒癥或感染性休克的患者中，只有一小部分患者的血培養(yǎng)呈陽(yáng)性[14]；重癥患者血培養(yǎng)陽(yáng)性率在25%左右[15]。但本研究中，膿毒癥患者血培養(yǎng)陽(yáng)性率為19.35%，低于文獻(xiàn)報(bào)道水平。血培養(yǎng)陽(yáng)性率與患者是否存在血流感染、血標(biāo)本留取前抗感染藥物的使用和是否在寒戰(zhàn)高熱時(shí)采集標(biāo)本等因素有關(guān)；同時(shí)血培養(yǎng)標(biāo)本采集技術(shù)缺陷以及局部病灶、特殊病原體，血液中病原菌濃度低也是影響血培養(yǎng)陽(yáng)性率低的重要原因。

本組資料中，NGS陽(yáng)性率為74.39%，明顯高于血培養(yǎng)的陽(yáng)性率。研究[16-17]表明，由于NGS檢測(cè)病原體核酸片段不受病原體活力及抗感染藥物暴露的影響,檢測(cè)陽(yáng)性率高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法。此外，臨床血培養(yǎng)陽(yáng)性率低的另一個(gè)原因?yàn)榭琉B(yǎng)菌、非細(xì)菌、真菌等病原體由于培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)或無(wú)法通過(guò)常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)獲得明確病原體結(jié)果。本研究結(jié)果表明，細(xì)菌類病原體只占病原體的一部分，細(xì)菌類常見(jiàn)病原體以鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌等占比最高。與血培養(yǎng)相比，NGS不僅能診斷出細(xì)菌、真菌類病原體，對(duì)病毒感染、罕見(jiàn)病菌及混合感染的檢測(cè)具有更大優(yōu)勢(shì)。本研究表明，NGS檢測(cè)出2種及以上病原體占54.88%，遠(yuǎn)高于血培養(yǎng)。血培養(yǎng)報(bào)告單一病原體的原因還與不同病原體在培養(yǎng)過(guò)程中存在競(jìng)爭(zhēng)性生長(zhǎng)等有關(guān)[14]，而NGS可檢測(cè)出多個(gè)核酸片段，不受該因素影響[16-17]。

本研究NGS檢測(cè)結(jié)果中檢測(cè)出現(xiàn)多種病毒，主要包括CMV、EBV、HSV-1等；常規(guī)血細(xì)菌培養(yǎng)無(wú)法檢測(cè)出病毒，目前臨床病毒檢測(cè)主要依賴于PCR和抗體檢測(cè)，雖然PCR和抗體檢測(cè)方法常作為診斷主要依據(jù)，但其存在嚴(yán)重缺陷，需臨床醫(yī)生先預(yù)判病原體種類，再進(jìn)行針對(duì)性的PCR擴(kuò)增或抗體檢測(cè)，受限因素較多，檢測(cè)陽(yáng)性率低。NGS檢出病毒主要包括CMV、HSV、EBV以及其他臨床不常見(jiàn)病毒，陽(yáng)性例數(shù)及檢測(cè)種類明顯高于PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果。NGS的AUC、靈敏度和特異度分別為0.628、80.6%、45.0%，較PCR的0.632、36.4%、90.0%，靈敏度高而特異度較低。病毒感染在膿毒癥中的地位仍不明確，部分學(xué)者研究建議[18]，病毒檢測(cè)應(yīng)作為重癥患者病原體檢測(cè)的重要組成部分，以指導(dǎo)更加精準(zhǔn)的抗感染診療方案制定；部分膿毒癥患者常存在病毒與細(xì)菌混合感染，此類患者病情更為嚴(yán)重。

NGS在檢測(cè)時(shí)間上優(yōu)勢(shì)明顯，需(1.32±0.26)d，明顯低于血培養(yǎng)的(5.61±1.22)d。國(guó)外研究[19]報(bào)道NGS檢測(cè)周期最短約為6 h。膿毒癥患者病情危重、進(jìn)展快速，故早期、精準(zhǔn)地抗感染治療對(duì)于改善患者預(yù)后、降低患者病死率至關(guān)重要[12]；同時(shí)精準(zhǔn)地抗感染治療對(duì)改善全球愈發(fā)嚴(yán)重的抗菌藥物濫用問(wèn)題[20]有著促進(jìn)作用。因此，NGS早期運(yùn)用，尤其對(duì)考慮常規(guī)檢測(cè)方法效果不佳、需快速獲得病原體的重癥患者意義更大。

本研究不足之處：(1)對(duì)于NGS和血培養(yǎng)結(jié)果判讀，仍缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來(lái)識(shí)別檢測(cè)到的微生物是否為病原菌，本研究中，雖然由3位高級(jí)職稱醫(yī)師根據(jù)患者的臨床特點(diǎn)結(jié)合其他輔助檢查結(jié)果得出，但主觀偏見(jiàn)仍然不可避免。(2)NGS靈敏度高，在檢測(cè)過(guò)程中需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作，否則容易導(dǎo)致臨床誤判。(3)由于檢測(cè)引物限制，在本次研究中PCR送檢目標(biāo)均為考慮病毒感染患者，影響研究結(jié)果程度難以有效確定。本研究為單中心研究，樣本量較小，研究結(jié)論還需要在大規(guī)模的臨床研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。