基于TGF－β1/Smad3信號通路探討黃芪甲苷對甲狀腺功能減退幼鼠腎損傷的改善作用

張暉，劉鵬，常毅娜，李曉樂

（1.河南科技大學第一附屬醫院，河南 洛陽 471000；2.鄭州大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450000）

甲狀腺功能減退癥（hypothyroidism，HT）是由于甲狀腺無法正常產生滿足機體需要的甲狀腺激素（thyroid hormone，THs）所引起的一種內分泌系統疾病［1-2］，其中未經治療的HT 嬰兒和新生兒有永久性智力低下風險，超過3 歲的兒童在HT 發作時也可能發生輕微認知障礙，身材矮小和骨齡延遲為HT 常見的兩種表現，嚴重影響患者的生活質量［3］。THs 影響腎臟發育、腎臟血流動力學、腎小球濾過率以及鈉和水的穩態［4］，HT 患者常伴有腎功能損傷，但關于HT 腎功能不全的機制尚不完全清楚，研究發現，HT 與腎臟纖維化的進展相關［5］，因此探討HT 與腎纖維化損傷所致的腎功能不全表現對于HT 并發癥的預防及治療具有重要意義。轉化生長因子－β（transforming growth factor－β1，TGF－β）是一種通過上調細胞外基質（extracellular matrix，ECM）表達和促進腎纖維化而導致腎損傷的有效致病因子，大量研究表明，TGF－β1/Smad3 通路失調是組織纖維化的重要致病機制［6］。黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AS－Ⅳ）是從中藥黃芪中提取的天然三萜糖苷，具有抗炎、抗氧化和抗纖維化等多種藥理活性［7］，研究發現其可抑制TGF－β1 誘導的腎纖維化［8］，但關于AS－Ⅳ是否可通過TGF－β1/Smad3 信號通路改善HT 幼鼠腎損傷的報道較少。6－丙基－2－硫尿嘧啶（6－propyl－2－thiouracil，PTU）是一種用于治療甲狀腺功能亢進的藥物，也被廣泛應用于誘導嚙齒動物甲狀腺功能減退的實驗中［1］，故本研究擬利用PTU 構建HT 幼鼠模型，并以HT 經典治療藥物左甲狀腺素鈉（levothyroxine sodium，LS）為陽性對照，探討AS－Ⅳ對HT 幼鼠腎損傷的改善作用及可能作用機制，以期為HT 伴隨的腎功能不全機制提供一定的理論依據及參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

30日齡SPF 級Wistar 大鼠60 只，雌雄均可，體質量（70±10）g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，生產許可號：SCXK（湘）2019－001。

1.1.2 藥品、主要試劑和儀器

AS－Ⅳ（純度＞98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；PTU（純度≥99%，美國Sigma公司）；LS（國藥準字H20010522，25 μg，深圳市中聯制藥有限公司）；考馬斯亮藍G250（北京索萊寶科技有限公司）；Masson染色試劑盒（北京雷根生物技術有限公司）；游離三碘甲腺原氨酸（free triiodothyronine，FT3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，FT4）及促甲狀腺素（thyrotropin，TSH）ELISA檢測試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司）；兔抗TGFβ1、Smad3、p－Smad3、Smad7、α－平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α－SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ，Col Ⅰ）多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；兔抗TGF－β受體Ⅰ型（TGF－β Receptor type Ⅰ，TβRI）多克隆抗體（SCBT公司）；全自動生化分析儀（中山新銳醫療設備科技有限公司）；多功能酶標儀（南京德鐵生物科技有限公司）；Bio－Rad凝膠成像系統（美國伯樂公司）。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組及給藥

恒溫（22 ± 2）℃、恒濕環境下普通飼養，12 h 光照/12 h 黑暗交替，適應1 周后，隨機選擇10 只幼鼠作為正常組，剩余50 只參考文獻［9］用于構建HT 幼鼠模型。連續28 d 灌胃6 mg/kg 劑量的PTU 后通過股動脈采血，評估血清中的FT3、FT4 及TSH 水平以確認大鼠甲狀腺功能狀態，當FT3 ≤（107.2 ± 0.8）ng/mL，FT4 ≤（1.7±0.6）ng/mL 且TSH ≥（19.60±3.08）mIU/L時即為甲狀腺功能減退［10］。經評估，成功構建HT 幼鼠模型共43 只，隨機剔除3 只后，剩余40 只隨機分為模型組、AS－Ⅳ低劑量組、AS－Ⅳ高劑量組及LS 組，每組各10 只。AS－Ⅳ低、高劑量組大鼠均灌胃AS－Ⅳ，給藥劑量分別為20、40 mg/（kg·d）；LS 組灌胃LS，給藥劑量為5 μg/（kg·d），正常組及模型組大鼠每日灌胃等體積生理鹽水，連續干預5 周。干預期間為保證甲狀腺功能處于減退狀態，繼續灌胃6 mg/kg 劑量的PTU，1 次/2 d。

1.2.2 標本采集與處理

末次給藥后，將幼鼠分別置于單獨的代謝籠中收集24 h 尿液樣本，以檢測24 h 尿白蛋白（albumin，Alb）含量。再將各組幼鼠腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，稱重，心臟取血，3 000 r/min，4 ℃離心15 min，取血清－80 ℃保存，用于ELISA 及生化檢測；脫頸處死，取左腎組織，稱重后保存于4%多聚甲醛中固定，用于HE 及Masson 染色；取右腎組織稱重，切碎后保存于液氮中，用于Western blot檢測。

1.2.3 ELISA法檢測FT3、FT4及TSH水平

設置標準品孔、樣本孔及空白孔，根據說明書配制所需試劑，分別將樣品（5 倍稀釋）及標準品液加入相應檢測孔內，抗體包被溫育，洗板，加入酶結合物工作液，洗板，加入顯色工作液后終止液終止反應，450 nm 波長處測定各孔OD 值，以標準品濃度作橫坐標，對應OD 值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各組幼鼠血清中FT3、FT4 及TSH水平。

1.2.4 腎臟臟器系數測定

采用腎臟臟器系數評估腎臟損傷情況，計算公式如下：

腎臟臟器系數（%）= 全腎重（g）/體質量（g）×100%

1.2.5 Bradford法測定大鼠24 h尿Alb含量

于96 孔板標準孔內加入不同濃度標準品，于待測樣本孔內加入稀釋10倍的尿液樣本，均加入200 μL考馬斯亮藍G250 染色液，緩慢吹打混勻，室溫靜置反應5 min 后，去除氣泡，于570 nm 波長處測定各孔吸光度值，繪制標準曲線并計算尿液樣本24 h尿Alb含量。

1.2.6 HE染色法觀察腎組織形態學變化

腎組織經4%多聚甲醛固定過夜，常規石蠟包埋并制備為4 μm切片，二甲苯、梯度乙醇及蒸餾水脫蠟，蘇木精染液染核5 min，鹽酸乙醇分化10 s，氨水返藍，伊紅染液染色2 min，脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。

1.2.7 Masson染色法觀察腎組織膠原蛋白沉積情況

切片常規脫蠟，Weigert 鐵蘇木素染色4 min，酸性乙醇分化20 s，Masson 藍化液返藍，麗春紅品紅染液染色5 min，弱酸溶液洗滌，磷鉬酸溶液洗滌2 min，弱酸工作液洗滌，苯胺藍溶液浸泡1 min，弱酸溶液洗滌，脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。腎區膠原染色呈藍色，用于評估腎纖維化。

1.2.8 Western blot 法檢測TGF－β1/Smad3 信號通路相關因子蛋白表達情況

取液氮中腎組織，碾碎后移至裂解液中勻漿裂解，12 000g（離心半徑24 cm）低溫離心10 min，取上清。測定全蛋白濃度并統一加熱變性蛋白，SDS－PAGE 凝膠電泳（壓縮膠60 V，25 min，分離膠120 V，60 min）分散蛋白條帶，轉膜（濕轉200 mA，120 min）后將PVDF膜于5%脫脂奶粉中封閉2 h；一抗（α－SMA 以1∶500稀釋，其他抗體均以1：1 000 稀釋）內4 ℃孵育過夜；次日洗膜，換液3 次，每次15 min，二抗（1∶8 000 稀釋）孵育2 h，洗膜并換液3次，每次15 min，ECL顯影，利用化學發光凝膠成像系統曝光并拍照記錄。采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白TGF－β1、TβRI、Smad3、Smad7、α－SMA 及Col Ⅰ與內參GAPDH 灰度值比值表示蛋白的相對表達量，以p－Smad3/Smad3 評估蛋白活化水平。

1.3 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件分析數據并進行統計學處理，計量結果以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較采用LSD－t檢驗。以P ＜0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組幼鼠血清FT3、FT4及TSH水平比較

ELISA 結果顯示，5 組幼鼠血清FT3、FT4 及TSH 水平差異具有統計學意義（P＜0.001）。進一步兩兩比較結果顯示，與正常組比較，其他4 組幼鼠血清FT3、FT4水平均降低，TSH 水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，AS－Ⅳ低、高劑量組及LS組幼鼠血清FT3、FT4水平升高，TSH 水平降低（P＜0.05）；與AS－Ⅳ低劑量組比較，AS－Ⅳ高劑量組及LS 組幼鼠血清FT3、FT4 水平升高，TSH水平降低（P＜0.05）；與AS－Ⅳ高劑量組比較，LS 組幼鼠血清FT3、FT4 水平升高，TSH 水平降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組幼鼠血清FT3、FT4及TSH水平比較（±s，n=10）

表1 各組幼鼠血清FT3、FT4及TSH水平比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與AS－Ⅳ低劑量組比較，cP ＜0.05；與AS－Ⅳ高劑量組比較，dP ＜0.05。

組別正常組模型組AS－Ⅳ低劑量組AS－Ⅳ高劑量組LS組F值P值FT3（ng/mL）118.89±6.54 47.81±3.63a 60.26±4.18ab 86.01±5.80abc 107.09±6.63abcd 300.279＜0.001 FT4（ng/mL）3.15±0.36 0.71±0.10a 0.99±0.12ab 1.57±0.11abc 2.39±0.27abcd 212.368＜0.001 TSH（mIU/L）5.69±0.44 27.76±3.36a 23.24±2.36ab 16.26±1.16abc 9.47±1.07abcd 216.537＜0.001

2.2 各組幼鼠腎臟臟器系數比較

計量結果顯示，5組幼鼠腎臟臟器系數差異具有統計學意義（P＜0.001）。進一步兩兩比較結果顯示，與正常組比較，其他4 組幼鼠腎臟臟器系數均升高（P＜0.05）；與模型組比較，AS－Ⅳ低、高劑量組及LS組幼鼠腎臟臟器系數降低（P＜0.05）；與AS－Ⅳ低劑量組比較，AS－Ⅳ高劑量組及LS 組幼鼠腎臟臟器系數降低（P＜0.05）；與AS－Ⅳ高劑量組比較，LS組幼鼠腎臟臟器系數降低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組幼鼠腎臟臟器系數結果比較（±s，%）

表2 各組幼鼠腎臟臟器系數結果比較（±s，%）

注：與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與AS－Ⅳ低劑量組比較，cP ＜0.05；與AS－Ⅳ高劑量組比較，dP ＜0.05。

組別正常組模型組AS－Ⅳ低劑量組AS－Ⅳ高劑量組LS組F值P值n 10 10 10 10 10腎臟臟器系數0.55±0.03 1.38±0.15a 1.09±0.12ab 0.89±0.09abc 0.68±0.06abcd 110.071＜0.001

2.3 各組幼鼠24 h尿Alb含量比較

Bradford 法檢測結果顯示，5 組幼鼠24 h 尿Alb 含量差異具有統計學意義（P＜0.001）。進一步兩兩比較結果顯示，與正常組比較，其他4組幼鼠24 h尿Alb含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，AS－Ⅳ低、高劑量組及LS組幼鼠24 h尿Alb含量降低（P＜0.05）；與AS－Ⅳ低劑量組比較，AS－Ⅳ高劑量組及LS組幼鼠24 h尿Alb含量降低（P＜0.05）；與AS－Ⅳ高劑量組比較，LS組幼鼠24 h尿Alb含量降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組幼鼠24 h尿Alb含量比較（±s，mg/24 h）

表3 各組幼鼠24 h尿Alb含量比較（±s，mg/24 h）

注：與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與AS－Ⅳ低劑量組比較，cP ＜0.05；與AS－Ⅳ高劑量組比較，dP ＜0.05。

組別正常組模型組AS－Ⅳ低劑量組AS－Ⅳ高劑量組LS組F值P值n 10 10 10 10 10 24 h尿Alb 13.23±1.51 31.88±3.81a 26.66±2.41ab 19.28±1.64abc 17.27±1.48abcd 102.536＜0.001

2.4 各組幼鼠血清肌酐（Serum creatinine，Scr）及尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）含量比較

生化檢測結果顯示，5組幼鼠血清Scr及BUN 含量差異具有統計學意義（P＜0.001）。進一步兩兩比較結果顯示，與正常組比較，模型組幼鼠血清Scr 及BUN含量均升高（P＜0.05）；與模型組比較，AS－Ⅳ低、高劑量組及LS 組幼鼠血清Scr 及BUN 含量降低（P＜0.05）；與AS－Ⅳ低劑量組比較，AS－Ⅳ高劑量組及LS 組幼鼠血清Scr 及BUN 含量降低（P＜0.05）；與AS－Ⅳ高劑量組比較，LS 組幼鼠血清Scr 及BUN 含量（P＜0.05）。見表4。

表4 各組幼鼠血清Scr、BUN含量比較（±s）

表4 各組幼鼠血清Scr、BUN含量比較（±s）

注：與正常組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05；與AS－Ⅳ低劑量組比較，cP ＜0.05；與AS－Ⅳ高劑量組比較，dP ＜0.05。

組別正常組模型組AS－Ⅳ低劑量組AS－Ⅳ高劑量組LS組F值P值n 10 10 10 10 10 Scr（μmol/L）23.35±2.44 65.85±4.68a 57.79±3.48b 42.07±2.84bc 31.18±3.45bcd 263.220＜0.001 BUN（mmol/L）6.34±0.35 25.14±2.15a 19.47±1.49b 13.79±1.14bc 9.49±0.95bcd 312.939＜0.001

2.5 各組幼鼠腎組織形態學變化比較

HE 染色結果顯示，正常組幼鼠腎小球形狀規則、結構完整，腎小管上皮細胞排列整齊；模型組幼鼠可見有明顯腎間質損傷，系膜基質增多，基底細胞增生，管腔狹窄，炎性細胞嚴重浸潤；AS－Ⅳ低、高劑量組及LS 組幼鼠腎組織損傷逐漸有所改善。見圖1。

圖1 腎組織HE染色結果（×400）

2.6 各組幼鼠腎組織纖維化情況比較

Masson 染色結果顯示，正常組幼鼠腎組織結構清晰，膠原纖維表達極少，主要分布于系膜和腎間質中；模型組幼鼠腎小球系膜區和腎間質區見有大量膠原纖維表達和沉積，組織纖維化病理改變明顯；與模型組比較，AS－Ⅳ低、高劑量組及LS 組幼鼠膠原纖維沉積情況逐漸減輕，腎纖維化逐漸改善。見圖2。

圖2 腎組織Masson染色結果（×400）

2.7 各組幼鼠腎組織中TGF－β1/Smad3 信號通路相關因子蛋白相對表達情況比較

Western blot 結果顯示，除Smad3 蛋白相對表達水平無統計學意義（P＞0.05）；5 組幼鼠腎組織中TGFβ1、TβRI、Smad7、α－SMA、Col Ⅰ蛋白相對表達水平及p－Smad3/Smad3差異具有統計學意義（P＜0.001）。進一步兩兩比較結果顯示，與正常組比較，模型組幼鼠腎組織中TGF－β1、TβRI、α－SMA、Col Ⅰ蛋白相對表達水平及p－Smad3/Smad3 蛋白活性水平升高，Smad7蛋白相對表達水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，AS－Ⅳ低、高劑量組及LS 組幼鼠腎組織中TGF－β1、TβRI、α－SMA、Col Ⅰ蛋白相對表達水平及p－Smad3/Smad3 蛋白活性水平下降，Smad7 蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；與AS－Ⅳ低劑量組比較，AS－Ⅳ高劑量組及LS 組幼鼠腎組織中TGF-β1、TβRI、α－SMA、Col Ⅰ蛋白相對表達水平及p－Smad3/Smad3 蛋白活性水平下降，Smad7 蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）；與AS－Ⅳ高劑量組比較，LS 組幼鼠腎組織中TGF－β1、TβRI、α－SMA、Col Ⅰ蛋白相對表達水平及p－Smad3/Smad3 蛋白活性水平下降，Smad7 蛋白相對表達水平升高（P＜0.05）。見圖3、表5。

圖3 腎組織中相關蛋白Western blot條帶圖

表5 各組幼鼠腎組織中TGF－β1/Smad信號通路相關蛋白相對表達情況（±s，n=10）

表5 各組幼鼠腎組織中TGF－β1/Smad信號通路相關蛋白相對表達情況（±s，n=10）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與AS-Ⅳ低劑量組比較，cP＜0.05；與AS-Ⅳ高劑量組比較，dP＜0.05。

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3 討論

盡管甲狀腺功能障礙疾病是常見、易于識別和治療的疾病，但若未確診或未經及時治療，可能會導致嚴重不良性反應［11－12］。THs 對腎臟生長、發育以及維持水和電解質的穩態至關重要，反過來，腎臟同樣影響著THs 代謝。一方面，腎損傷見于原發性和自身免疫性HT，另一方面，非自身免疫性HT 在蛋白尿患者中更為常見，進一步表明HT 與腎損傷之間存在密切聯系［13］。

研究發現，垂體衍生的TSH 增加至一定水平與HT 相關，健康甲狀腺可合成并分泌T4 和活性更強的T3，因此TSH、FT3 及FT4 水平高低可提示HT 的發生與否［14］。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清FT3、FT4 水平顯著降低，TSH 水平顯著升高，提示成功構建HT 幼鼠模型。腎臟臟器系數增大可能與炎癥、增生相關，24 h 尿Alb、Scr 及BUN 含量常用于評估腎功能［15］。研究發現，腎纖維化大鼠腎臟臟器系數、24 h 尿Alb、血清Scr 及BUN 含量均見顯著增加［16］，本研究結果顯示，與正常組比較，模型組幼鼠腎臟臟器系數、24 h 尿Alb、血清Scr 及BUN 含量均顯著增加，提示HT 幼鼠存在腎功能損傷；經病理組織學染色觀察發現，模型幼鼠腎組織系膜基質增多，基底細胞增生，管腔狹窄，炎性細胞嚴重浸潤，腎小球系膜區和腎間質區見有大量膠原纖維表達和沉積，提示HT 可能導致腎組織結構病理損傷及腎纖維化改變，進而引起腎功能障礙。研究發現，AS－Ⅳ可改善糖尿病小鼠腎小球及腎小管損傷，降低尿白蛋白含量［17］，抑制腎小管間質纖維化［18］，本研究結果顯示，AS－Ⅳ低、高劑量組均可降低腎功能損傷生理參數，改善腎組織結構及膠原蛋白沉積情況，提示AS－Ⅳ對于HT 幼鼠所致的腎損傷可發揮一定的改善作用。

纖維化主要表現為肌成纖維細胞活化（如標志物α－SMA高表達）以及以膠原蛋白（如Col Ⅰ）為主的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的過度沉積［19］。本研究結果顯示，模型組幼鼠腎組織中α－SMA、Col Ⅰ蛋白相對表達水平顯著升高，而經AS－Ⅳ治療后，兩者表達水平均降低，提示AS－Ⅳ可改善HT 幼鼠腎組織纖維化。TGF－β1 是一種主要的促纖維化因子，在與其受體TβRI 結合后通過激活下游介質包括Smad3 以發揮其生物活性，如ECM 的產生，該過程受Smad7 的負調控［20］。研究發現，驅動TGF－β1/Smad3信號通路可促進腎纖維化發展［21］。另有研究發現，AS－Ⅳ可通過抑制TGF－β1 信號及Smad3 磷酸化，促進Smad7高表達進而抑制二氧化硅誘導的肺成纖維細胞纖維化［22］，本研究結果顯示，模型組幼鼠腎組織中TGF－β1、TβRI蛋白相對表達及p－Smad3/Smads水平顯著升高，Smad7 蛋白相對表達水平降低，提示HT 幼鼠腎組織中TGF－β1/Smad3 信號通路處于被激活狀態，而經AS－Ⅳ治療后，TGF－β1、TβRI蛋白相對表達及p－Smad3/Smads 水平顯著降低，Smad7 蛋白相對表達水平升高，提示AS－Ⅳ可能通過抑制TGF－β1/Smad3信號通路激活進而抑制腎組織纖維化進展并改善腎損傷。

綜上所述，AS－Ⅳ可減輕HT 幼鼠腎組織病理結構及腎纖維化改變，改善腎功能，其作用機制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號通路激活有關。