微量動(dòng)態(tài)顯色法與動(dòng)態(tài)顯色法的等效性評(píng)價(jià)

裴宇盛，陳 晨，耿 穎，高 華，蔡 彤

(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

細(xì)菌內(nèi)毒素是注射劑中熱原污染的重要指標(biāo)，在GMP生產(chǎn)條件下，無(wú)內(nèi)毒素意味著無(wú)熱原[1]。細(xì)菌內(nèi)毒素的質(zhì)量控制方法為細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，該方法是使用海洋生物鱟為原料而生產(chǎn)的專(zhuān)用試劑，在我國(guó),近年來(lái)，由于環(huán)境惡化、過(guò)度捕撈等多種原因，我國(guó)的鱟資源已經(jīng)表現(xiàn)出了迅速衰退的趨勢(shì)。在2019年，國(guó)際組織將中國(guó)鱟資源由原來(lái)的“缺乏數(shù)據(jù)”調(diào)整為“瀕危”級(jí)別[2]，到了2021年初，中國(guó)將中國(guó)鱟和圓尾蝎鱟列入國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物名錄。鱟資源勢(shì)必收到嚴(yán)格的管控。而我國(guó)對(duì)鱟資源的需求卻逐年增多。因此，現(xiàn)有內(nèi)毒素檢查法的補(bǔ)充替代方法的研究迫在眉睫。國(guó)內(nèi)外有多種替代方法，如重組C因子法和單核細(xì)胞活化反應(yīng)檢查法以及微量鱟試劑法。前兩種方法已經(jīng)被中國(guó)藥典2020年版9251指南和9301指南收錄，并且這兩種方法已經(jīng)有較多研究。微量鱟試劑法是國(guó)內(nèi)為了應(yīng)對(duì)鱟資源減少而研發(fā)的一類(lèi)方法，目前已經(jīng)出現(xiàn)微量凝膠法和微量動(dòng)態(tài)顯色法。本研究聚焦于微量動(dòng)態(tài)顯色法(micro kinetic chromogenic assay, mKCA)，該方法在不改變?cè)囼?yàn)原理的情況下，試驗(yàn)操作與經(jīng)典方法相同，僅鱟試劑的使用量減少為原方法的1/4。本研究采用微量動(dòng)態(tài)顯色法與經(jīng)典動(dòng)態(tài)顯色法(kinetic chromogenic assay, KCA)進(jìn)行比對(duì)研究，通過(guò)在國(guó)內(nèi)多個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)作研究，并采用多種統(tǒng)計(jì)方法對(duì)兩種方法進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)兩種方法的等效性，為方法替代提供數(shù)據(jù)支持。以達(dá)到減少鱟資源消耗，提高鱟試劑使用效率，間接保護(hù)鱟資源的目的。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑Multiskan FC/ET型酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)。Robot 100型全自動(dòng)細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)系統(tǒng)(湛江安度斯生物有限公司)。細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品(貨號(hào)150800-201601)，產(chǎn)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑(貨號(hào)10-0.01 EU·mL-1)，購(gòu)自湛江安度斯生物有限公司；動(dòng)態(tài)顯色法鱟試劑(貨號(hào)10～0.01 EU·mL-1，2.8 mL)，購(gòu)買(mǎi)自廈門(mén)鱟試劑生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1檢測(cè)方法 采用動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑，每孔樣品和鱟試劑加樣量25 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm，預(yù)設(shè)OD值0.03。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 用內(nèi)毒素檢查用水稀釋內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品制備濃度為5、0.5、0.05、0.005 EU·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用半孔酶標(biāo)板(安度斯)，96空板(安度斯)分別進(jìn)行檢測(cè)，每組重復(fù)3次。

1.2.3替代方法研究 用注射用水稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品制備3.16、0.316和0.0316 EU·mL-1溶液。同時(shí)采用動(dòng)態(tài)濁度法和微量動(dòng)態(tài)濁度法進(jìn)行檢測(cè)，為了評(píng)價(jià)不同廠家來(lái)源的鱟試劑(以A廠家和B廠家代稱(chēng))對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，試驗(yàn)參照精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)[3]，采用2個(gè)廠家鱟試劑，3個(gè)不同濃度，每個(gè)廠家的鱟試劑檢測(cè)重復(fù)3次，在4家實(shí)驗(yàn)室同時(shí)進(jìn)重現(xiàn)性驗(yàn)證。

1.2.4統(tǒng)計(jì)方法 使用JMP13軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析，對(duì)各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間的差異是否具有顯著性。采用配對(duì)t檢驗(yàn)對(duì)替代方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。采取F雙邊檢驗(yàn)對(duì)方差齊性，采取方法welch檢驗(yàn)方差均值。采用等效性以?xún)杉以噭﹦?dòng)態(tài)顯色法各自為參考方法，微量動(dòng)態(tài)法為比對(duì)方法對(duì)兩種方法的等效性進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 替代方法的單因素方差分析單因素方差分析結(jié)果見(jiàn)Tab 1。單因素方差分析的結(jié)果顯示，使用兩個(gè)廠家的鱟試劑(A和B)的各自參考方法和替代方法差異并沒(méi)有顯著性，表明就A和B單獨(dú)來(lái)看，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間、各個(gè)濃度組之間以及參考方法之間均沒(méi)有差異。但是A和B的參考方法的單因素方差分析具有顯著性則說(shuō)明兩個(gè)廠家之間的差異有顯著性。

Tab 1 Results of One way ANOVA (n=36)

2.2 配對(duì)t檢驗(yàn)配對(duì)t檢驗(yàn)的結(jié)果與單因素方差分析的結(jié)果類(lèi)似，結(jié)合單因素方差分析的結(jié)果來(lái)看，表明了就A試劑和B試劑單獨(dú)來(lái)看，兩種方法之間的差異無(wú)顯著性。但是A試劑和B試劑的參考方法的具有顯著性。見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Results of t test(n=36)

2.3 方差齊性檢驗(yàn)在方差齊性方面，A廠家試劑顯示出差異有顯著性，表明使用微量法檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果的離散程度比參考方法大，進(jìn)一步評(píng)價(jià)方差采用Welch檢驗(yàn)評(píng)價(jià)方差均值的差異顯著性。該檢驗(yàn)即使對(duì)于方差不齊的結(jié)果仍然可以進(jìn)行比較。檢驗(yàn)結(jié)果顯示A和B兩個(gè)廠家的試劑的方差均值差異無(wú)顯著性。F檢驗(yàn)和Welch檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)Tab 3。

Tab 3 Results of F test and Welch test(n=36)

2.4 等效性檢驗(yàn)等效性檢驗(yàn)在進(jìn)行比較時(shí)，需要設(shè)定指定的實(shí)際差值閾值，該數(shù)值越大對(duì)比較的兩種方法差異的容忍程度越大。當(dāng)閾值為10的情況下，A和B試劑各自的參考方法和替代方法之間即等效。而A和B試劑的參考方法之間是不等效的。在日常檢測(cè)實(shí)踐中，A和B廠家的參考方法即目前國(guó)內(nèi)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法動(dòng)態(tài)顯色法的經(jīng)典方法。從藥典的合規(guī)性來(lái)說(shuō)兩種方法均為法定檢測(cè)方法，其檢測(cè)結(jié)果應(yīng)視為等效。因此，研究決定調(diào)整閾值直到A試劑和B試劑的參考方法之間為等效。經(jīng)過(guò)計(jì)算，指定的實(shí)際差值閾值為20時(shí)，無(wú)論A試劑和B試劑參考方法之間，還是A試劑和B試劑各自參考方法和替代方法之間，均為等效。等效性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)Tab 4。

Tab 4 Results of equivalence test(n=36)

3 討論

在兩種方法的比對(duì)評(píng)價(jià)過(guò)程中，采用了多種統(tǒng)計(jì)方法來(lái)評(píng)價(jià)，主要考慮內(nèi)毒素檢測(cè)屬于生物測(cè)定法，更接近動(dòng)物試驗(yàn)，應(yīng)使用等效性檢驗(yàn)。單因素方差分析、配對(duì)t檢驗(yàn)和等效性檢驗(yàn)的結(jié)果較為一致，均顯示出不同廠家的現(xiàn)有動(dòng)態(tài)顯色法之間存在一定差異而每個(gè)廠家的試劑采用微量或常規(guī)的量之間并不存在顯著性差異。這表明在動(dòng)態(tài)顯色法方面，影響結(jié)果的主要因素是不同來(lái)源的鱟試劑，而非鱟試劑的使用量。值的注意的是，兩個(gè)廠家的試劑使用參考方法在t檢驗(yàn)中表現(xiàn)出了差異顯著性以及在等效性檢驗(yàn)閾值設(shè)置為10時(shí)表現(xiàn)出不等效，說(shuō)明了我國(guó)這倆家試劑目前采用藥典方法即存在一定差異。關(guān)于此問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。這也表明了細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法本身就具有較大誤差，其作為一種生物檢定方法的具有一定特殊性。為了減少人員稀釋過(guò)程的誤差，本研究采用了全自動(dòng)內(nèi)毒素稀釋系統(tǒng)。最大程度的減少了除了試劑引入的誤差，從而更加真實(shí)準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)替代方法。

《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的加樣比例以及保溫時(shí)間等，參照所用的儀器和試劑的有關(guān)說(shuō)明進(jìn)行。即鱟試劑的加樣量并非僅有傳統(tǒng)的0.1 mL裝量。但對(duì)于國(guó)內(nèi)普遍采用0.1 mL檢驗(yàn)體系已經(jīng)多年，因此必須對(duì)微量動(dòng)態(tài)顯色法進(jìn)行方法等效性方面的研究。

綜上所述，本研究首次開(kāi)展了微量動(dòng)態(tài)顯色法與動(dòng)態(tài)顯色法之間的一致性研究，表明微量動(dòng)態(tài)顯色法在準(zhǔn)確度回收率方面是與現(xiàn)有試劑等效的。由于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法屬于生物測(cè)定法，目前藥典中尚無(wú)專(zhuān)門(mén)針對(duì)生物活性為機(jī)制的雜質(zhì)測(cè)定方法的方法評(píng)價(jià)指南，隨著內(nèi)毒素檢測(cè)應(yīng)用的不斷拓展[4-10]，必將有更多的替代方法和研究需要進(jìn)行方法的等效性研究，本研究為此類(lèi)方法替代方法研究提供一定參考。