七福飲調控JAK2/STAT3通路改善2型糖尿病認知障礙的效應與機制

劉 玲，張靜文，張瑞華，史磊磊，王 晨，韓朝軍，史永恒，王 斌，劉繼平

(陜西中醫(yī)藥大學, 陜西 咸陽 712000)

糖尿病認知障礙(diabetic cognitive impairment，DCI)是一種以輕度認知功能障礙為主的糖尿病并發(fā)癥，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)2型DCI的發(fā)病概率高于1型，且隨著病程的發(fā)展極易轉化為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)[1-3]。同時，高血糖也被認為是AD的重要發(fā)病因素之一[4]。但導致2型DCI和AD的發(fā)病機制目前還未完全闡明，長期高血糖刺激導致的慢性神經(jīng)炎癥可能是其共同的發(fā)病基礎[5]。小膠質細胞(microglia，MG)是中樞免疫反應的主要參與者，具有調節(jié)炎癥和免疫反應等功能，另外其分泌的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等發(fā)揮神經(jīng)保護功能[6]。慢性糖尿病患者腦內(nèi)小膠質細胞會被激活，分泌大量促炎因子和促氧化物質導致持續(xù)性炎癥從而危害認知功能[7]。因此調節(jié)小膠質細胞活化可能是2型DCI的治療靶點。

JAK/STAT(Janus kinase /signal transducer and activator of transcription)通路與細胞因子表達密切相關，是調控小膠質細胞活化的關鍵通路，研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁湯減少APP/PS1小鼠Aβ積累、減輕神經(jīng)炎癥、改善認知障礙的機制與抑制JAK2/STAT3通路表達有關[8]，但其與2型DCI的關系仍需進一步研究。

QFY是張景岳治療癡呆的傳統(tǒng)名方，研究發(fā)現(xiàn)QFY具有神經(jīng)保護作用，但其機制還未完全闡明[9]。QFY還具有一定抗炎、抗凋亡的作用[10]，所以QFY抗炎機制可能與抑制小膠質細胞活化、發(fā)揮修復神經(jīng)的功能相關。因此，本實驗旨在探討QFY對2型DCI大鼠海馬小膠質細胞活化以及對JAK2/STAT3通路變化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物12～24 周SPF級♂SD大鼠103只，體質量(180～220) g，通過成都達碩實驗動物有限公司購買，許可證號：SCXK(川)2020-030，于陜西中醫(yī)藥大學中藥藥理實驗室動物房飼養(yǎng)，本研究中動物實驗經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準同意。

1.2 藥物與試劑QFY組成為人參6 g，熟地9 g，當歸9 g，白術(炒)5 g，炙甘草3 g，酸棗仁6 g，制遠志5 g。以上中藥飲片均購于咸陽宜家大藥房，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室顏永剛教授鑒定為正品，符合2020版《中國藥典》一部相關規(guī)定。按照處方比例，十倍水煎煮1 h，收集濾液，殘渣加八倍水繼續(xù)煎煮40 min，過濾后合并濾液，減壓濃縮成生藥濃度分別為0.43 kg·L-1和0.86 kg·L-1的藥液，4 ℃保存。按照1 mL/100 g的體積灌胃。鹽酸二甲雙胍片(格華止，規(guī)格：0.5 g/片，中美上海施貴寶制藥有限公司)；鏈脲佐菌素(Sigma公司)；p-JAK抗體(3776S)、JAK抗體(3230S)、p-STAT3抗體(9145S)、STAT3抗體(9139S)均購于Cell Signaling Technology公司，β-actin抗體(10004156)購自Proteintech公司；Iba-1抗體(GB12105)購自武漢賽維爾生物科技有限公司；羊抗小鼠(BA1050)、羊抗兔(BA1054)、超敏ECL化學發(fā)光液(AR1197)均購自武漢博士德生物工程有限公司。ELISA試劑盒TNF-α(ml002859)、IL-6(ml102828)、IL-10(ml002813)和BDNF(ml302829)均購自于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 儀器羅氏血糖儀(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)；Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司)；酶標儀(美國BIOTEK公司)；電泳儀(美國Bio-Rad)；正置熒光顯微鏡與成像系統(tǒng)(日本尼康)。

1.4 方法

1.4.12型DCI模型建立及分組 造模方法參考[11]，適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分組，空白組10只，造模組93只?？瞻捉M飼喂普通飼料，造模組給予自制高脂高糖飼料(含基礎飼料59%、蔗糖20%、豬油18%、蛋黃3%)喂養(yǎng)4周，禁食16 h，造模組腹腔注射STZ 35 mg·kg-1，空白組注射相同劑量檸檬酸緩沖液。72 h后使用血糖儀檢測尾靜脈血糖，低于11.1 mmol·L-1的大鼠繼續(xù)補打1次，取空腹血糖>11.1 mmol·L-1的大鼠繼續(xù)給予高脂高糖飼料8周，最后1 d測定血糖，剔除未達標大鼠。水迷宮證明造模成功后設立模型組、QFY低(4.3 g·kg-1)、高(8.6 g·kg-1)組、二甲雙胍(200 mg·kg-1)組，每組各10只。灌胃4周后d 2禁食不禁水12 h，檢測各組血糖。

1.4.2行為學檢測 采用Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力。水迷宮四個象限邊緣設置標記，在目標象限設置一水平平臺后注水使水面沒過平臺，確保大鼠無法看見平臺，分別從4個象限將大鼠頭朝池壁放入水中，訓練大鼠尋找平臺。連續(xù)訓練5 d，記錄其逃避潛伏期，于d 6撤去平臺，記錄大鼠在目標象限的穿越次數(shù)。

1.4.3樣本采集 水迷宮測試結束后d 2麻醉取材。每組隨機選擇4只大鼠灌注后取出完整大腦置于4%多聚甲醛中，用于病理形態(tài)學檢測和免疫熒光染色；其余大鼠先腹主動脈采血得到血清，然后迅速脫頸處死取出兩側海馬組織，液氮速凍后與血清一同存放于-80 ℃。左側海馬制備成10%組織勻漿用于試劑盒檢測，右側海馬進行免疫蛋白印跡分析，全程在冰上操作。

1.4.4觀察指標與方法

1.4.4.1尼氏染色 腦組織在4 ℃、4%多聚甲醛溶液中固定24 h，隨后乙醇梯度脫水，二甲苯透明、兩次浸蠟、常規(guī)石蠟包埋、5 μm厚切片進行尼氏染色，400倍顯微鏡下觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞中尼氏小體的含量。

1.4.4.2免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，封閉，加Iba-1一抗(1 ∶3 000)，4 ℃孵育過夜，加二抗。DAPI復染細胞核，淬滅組織自發(fā)熒光，封片后鏡檢掃描，觀察并計數(shù)海馬DG區(qū)小膠質細胞標志物Iba-1的表達。DAPI為藍色熒光，Iba-1為紅色熒光。

1.4.4.3血清炎癥因子/抑炎因子及海馬中BDNF的檢測 嚴格按照ELISA試劑盒說明進行檢測TNF-α、IL-6、IL-10和BDNF的含量。

1.4.4.4Western blot 取大鼠右側海馬加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑后，在低溫冷凍研磨儀中充分研磨，4 ℃離心取上清液，BCA蛋白定量后，等量蛋白上樣，通過SDS-PAGE電泳分離，并轉移至0.22 μm PVDF膜上，在TBST中清洗后在5%的脫脂牛奶中封閉1 h,分別加入按比例配好的一抗：p-JAK2(1 ∶1 000)、JAK2(1 ∶1 000)、p-STAT3(1 ∶1 000)、STAT3(1 ∶2 000)、β-actin(1 ∶20 000)，4 ℃過夜；TBST洗膜3次，每次10 min。加入二抗：山羊抗鼠、山羊抗兔室溫孵育1 h；TBST洗膜3次,每次10 min，ECL化學發(fā)光顯影，利用ImageJ計算目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 QFY對2型DCI大鼠干預前后空腹血糖及體質量的影響Tab 1結果表明，4周后，模型組FBG明顯高于空白組(P<0.01)，而QFY(8.6 g·kg-1)組和二甲雙胍組血糖明顯低于模型組(P<0.05)；但各組與四周前相比較發(fā)現(xiàn)，模型組以及QFY(4.3 g·kg-1)組血糖均比干預前明顯上升(P<0.05，0.05)，而QFY(8.6 g·kg-1)組和二甲雙胍組則升高血糖不明顯，說明QFY(8.6 g·kg-1)組可以有效抑制2型DCI大鼠體內(nèi)血糖的持續(xù)升高。另外，模型組體質量明顯低于空白組(P<0.01)，而各給藥組體質量與模型組相差不大；但各組與四周前相比較發(fā)現(xiàn)，空白組體質量明顯上升(P<0.01)，模型組、二甲雙胍組以及QFY(8.6 g·kg-1)組體質量均比4周前明顯下降(P<0.01，0.05，0.05),而QFY(4.3 g·kg-1)組則和4周前相差不明顯，說明QFY組對抑制2型DCI大鼠體質量持續(xù)下降的影響不大。

Tab 2 Effect of QFY on escape latency and number of crossings in type 2 DCI rats / M±IQR，n=9-10)

2.2 QFY對2型DCI大鼠水迷宮成績的影響隨著訓練時間的增加，各組大鼠的逃避潛伏期均呈下降趨勢。但在d 5時，模型組大鼠逃避潛伏期明顯高于空白組(P<0.05)，而QFY低(P<0.01)、高劑量組(P<0.05)和二甲雙胍組(P<0.01)的逃避潛伏期均明顯低于模型組，這表明模型組的空間學習記憶能力明顯受損，而QFY和二甲雙胍干預后，學習記憶能力得到改善；撤去平臺后，模型組穿越目標平臺次數(shù)明顯低于空白組(P<0.05)，而高劑量組(P<0.01)和二甲雙胍組(P<0.05)大鼠穿越平臺成績則明顯高于模型組。綜上，QFY干預后，2型DCI大鼠的空間學習記憶能力能得到明顯提升。

2.3 QFY對2型DCI大鼠海馬尼氏染色的影響400×尼氏小體廣泛存在于神經(jīng)元的胞體中，尼氏小體分布均勻、數(shù)量多說明神經(jīng)細胞代謝功能強，若細胞受損，尼氏小體會減少甚至消失。對比空白組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元發(fā)現(xiàn)，模型組神經(jīng)元排列稀疏，細胞形態(tài)大小不一，部分胞體皺縮，胞內(nèi)尼氏小體著色淺、數(shù)量明顯減少，可見不同程度神經(jīng)元損傷。而給予QFY和二甲雙胍后，神經(jīng)元形態(tài)較好，胞內(nèi)尼氏小體的數(shù)目比模型組明顯增多，說明QFY干預可以有效減輕2型DCI大鼠神經(jīng)元損傷，起到保護神經(jīng)元的作用，見Fig 1。

Fig 1 Effect of QFY on Nissl bodies of hippocampus CA1 in type 2 DCI rats (×400) QFYL and QFYH represented QFY low and high dose group.

2.4 QFY對2型DCI大鼠海馬小膠質細胞的影響Iba-1是小膠質細胞的標志物，模型組海馬DG區(qū)小膠質細胞明顯增多(P<0.01)，而給予QFY不同劑量(P<0.01)和二甲雙胍(P<0.05)后均能有效降低小膠質細胞的數(shù)目，保護海馬免受炎癥損傷,見Fig 2,3。

Fig 2 Effect of QFY on expression of Iba-1 in hippocampus DG in type 2 DCI rats (×15)A: Control，B: Model，C: Metformin，D: QFYD，E: QFYH

Fig 3 Immunofluorescence results of Iba-1 in hippocampus DG n=4)##P<0.01 vs control；*P<0.05，**P<0.01 vs model.

2.5 QFY對2型DCI大鼠TNF-α、IL-6、IL-10和BDNF含量的影響與空白組相比，模型組血清中TNF-α(P<0.01)、IL-6(P<0.01)含量明顯升高，IL-10(P<0.01)和海馬組織中BDNF(P<0.01)明顯下降，說明2型DCI會引起大鼠體內(nèi)炎癥因子TNF-α和IL-6表達升高、抑炎因子IL-10和BDNF表達下降；給予QFY后，大鼠血清中TNF-α(P<0.05)和IL-6(P<0.05)的水平明顯下降，抑炎因子IL-10(P<0.01)明顯升高，BDNF的水平也明顯上升(P<0.01),見Tab 3。

Tab 3 Effect of QFY on contents of TNF-α, IL-6, IL-10 and BDNF in type 2 DCI rats , n=6)

Tab 4 Effect of QFY on expression of JAK2/STAT3 pathway in type 2 DCI n=6)

2.6 QFY對2型DCI大鼠JAK2/STAT3通路表達的影響與空白組相比，模型組的p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3的比值均明顯升高，而QFY不同劑量組和二甲雙胍組則能明顯降低JAK2和STAT3的磷酸化水平,見Fig 4。

Fig 4 Effect of QFY on expression of JAK2/STAT3 pathway in type 2 DCI rats A:Control，B: Model，C: Metformin，D: QFYD，E: QFYH)

3 討論

根據(jù)目前報道降糖藥二甲雙胍、格列本脲和羅格列酮等[12]雖然能減輕糖尿病認知損傷，但尚無有效針對治療2型DCI的藥物上市，仍需對其機制進行深入研究。采用中醫(yī)藥治療2型DCI具有一定優(yōu)勢，糖尿病久之則心脾兩虛，痰瘀互結，蒙蔽清竅，出現(xiàn)健忘癡呆，而QFY可扶正祛邪，杜絕痰瘀之內(nèi)生，又榮養(yǎng)腦神，改善病理損傷，這與本實驗研究結果一致，QFY能有效提升2型DCI大鼠水迷宮成績，提高其學習記憶能力，減輕神經(jīng)元損傷。相比模型組大鼠，QFY(8.6 g·kg-1)能明顯降低空腹血糖。注射STZ后，模型組血糖水平在4周內(nèi)持續(xù)升高，但QFY(8.6 g·kg-1)可以抑制血糖上升，使血糖水平保持穩(wěn)定，這可能使神經(jīng)病變的概率減小[3]。

近年來，2型糖尿病的“炎癥學說”被廣泛關注，部分學者認為其是一種慢性免疫性疾病，實驗研究發(fā)現(xiàn)小鼠飼喂高脂飼料并注射STZ后使其血糖升高能明顯增加其外周和海馬炎癥的發(fā)生，促進增加小膠質細胞和星形膠質細胞[13]。小膠質細胞活化后，能激活NADPH酶，釋放超氧陰離子以及促炎因子IFN、TNF-α、IL-6、IL-1β等損傷神經(jīng)元，除此之外，小膠質細胞還可以通過分泌BDNF、吞噬突觸等功能影響大腦發(fā)育和可塑性。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，QFY不同劑量組能明顯降低血清促炎因子TNF-α、IL-6水平，增加抑炎因子IL-10水平和海馬BDNF的含量，有效降低海馬部位Iba-1陽性表達，抑制小膠質細胞活化。

JAK2/STAT3作為調控小膠質細胞活化的通路之一，可響應炎癥因子如IL-6，被炎癥激活。研究發(fā)現(xiàn)抑制JAK2/STAT3通路磷酸化能有效改善大鼠腦缺血再灌注損傷[14-15]。本研究結果顯示，QFY不同劑量組能明顯抑制JAK2、STAT3的磷酸化水平，從而抑制炎癥。

綜上，本文研究結果顯示，QFY具有改善2型DCI大鼠認知功能、降低空腹血糖值、減輕神經(jīng)炎癥等作用，其機制與調控JAK2/STAT3信號通路及抑制小膠質細胞活化、保護神經(jīng)元等有關，為深入探究QFY的化痰祛瘀、扶正祛邪及腦保護作用提供了重要參考。