三七總皂苷通過調(diào)節(jié)TLR4/TLR2-NF-κB信號(hào)通路對再生障礙性貧血小鼠骨髓造血功能的影響

陳姍姍，吳澤彬，張小敏，馬 坤，朱玲玲，3

(南方醫(yī)科大學(xué) 1. 中醫(yī)藥學(xué)院，2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)金沙洲醫(yī)院血液科，廣東 廣州 510000； 3. 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510515)

再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)是一種由多種原因引起，以全血細(xì)胞減少、骨髓增生減低為特征的骨髓衰竭綜合征。AA發(fā)病主要涉及造血干細(xì)胞缺陷、造血微環(huán)境異常、免疫功能紊亂等因素，其中，免疫功能紊亂是AA發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。既往研究主要集中于T細(xì)胞亞群異常及細(xì)胞因子水平紊亂，近年來，作為啟動(dòng)和調(diào)控T細(xì)胞免疫應(yīng)答的樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)在AA發(fā)病中的作用不斷被發(fā)現(xiàn)且重視[2]，SAA患者骨髓中異常活化的DC數(shù)量增加和細(xì)胞表面共刺激分子異常表達(dá)，誘導(dǎo)骨髓中T細(xì)胞異常活化，進(jìn)而引起一系列免疫亢進(jìn)反應(yīng)。T淋巴細(xì)胞亞群異常、細(xì)胞因子紊亂，以及Fas/Fasl凋亡通路和Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)促炎信號(hào)通路[3]等多條信號(hào)通路的異常激活共同參與AA免疫異常，其中TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活還與DC異常活化關(guān)系密切[4]，且Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)能和TLR4共同介導(dǎo)跨細(xì)胞膜免疫信號(hào)[5]。然而，TLR4與TLR2激活后涉及多條下游信號(hào)通路，其中影響AA發(fā)病的具體作用靶點(diǎn)尚不清楚。

臨床治療AA的主要手段包括造血干細(xì)胞移植、免疫抑制療法和對癥治療等，環(huán)孢素(cyclosporine A，CsA)是治療AA的主要藥物之一，具有免疫抑制作用，可抑制異常活化的T細(xì)胞，降低TNF-α、IFN-γ、IL-2等炎癥細(xì)胞因子水平，一定程度上能夠改善AA病理狀態(tài)，可作為AA小鼠模型的陽性對照藥物，用于抗AA藥物的篩選[6]。CsA作為AA免疫抑制治療的主要藥物，然而其反應(yīng)率約為70%，仍有30%患者對免疫抑制治療無反應(yīng)，并且患者復(fù)發(fā)率較高。中醫(yī)藥治療AA療效確切，并且具有改善藥物不良反應(yīng)、提高患者生存質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)，挖掘能夠改善或扭轉(zhuǎn)AA免疫紊亂的中藥及其有效成分對改善AA療效具有重要意義。《本草綱目》記載：“三七止血、散血、定痛。”三七總皂苷(Panaxnotoginsengsaponins，PNS)是中藥三七的主要活性成分，主要包括皂苷單體Rb1、Rg1、Re及三七皂苷R1SE等，在心腦血管疾病、腫瘤、器官間質(zhì)性疾病等方面具有廣泛應(yīng)用，現(xiàn)代藥理研究表明，PNS具有改善微循環(huán)、抗凝、抗炎、抗氧化等作用[7]，能夠通過調(diào)節(jié)NF-κB、MAPKs、TGF-β/Smad以及Fas/Fasl等信號(hào)通路和細(xì)胞因子水平發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)PNS能夠通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群和外周血清TNF-α、IFN-γ水平來改善AA小鼠造血功能[9]，然而，PNS調(diào)節(jié)AA骨髓造血功能的具體信號(hào)通路尚不完全清楚，本文旨在通過建立再生障礙性貧血小鼠模型，觀察PNS對AA小鼠造血及免疫功能的調(diào)節(jié)作用，并探索具體機(jī)制，進(jìn)一步明確AA發(fā)病機(jī)制和PNS作用靶點(diǎn)，從而為PNS的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6♀小鼠，SPF級(jí)，8～10周齡，體質(zhì)量(18～20)g，共49只，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(浙)2019-0001，飼養(yǎng)在SPF級(jí)動(dòng)物房內(nèi)。FVB ♀小鼠，SPF級(jí)，8周齡，共10只，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(粵)2016-0167。

1.2 藥物與試劑PNS(生產(chǎn)批號(hào)：18101001，上海源葉公司)；CsA(注冊證號(hào)：H20140288，Novartis Pharma Schweiz AG)；白介素2(interleukin-2，IL-2)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素10(interleukin-10，IL-10)ELISA試劑盒(宏清生物科技，貨號(hào)分別為：HQ-20010、HQ-20220、HQ-20005)；CD11c、MyD88、Akt、NF-κB、MAPK、β-actin一抗(批號(hào)分別為：97585S、4283S、4691T、6956S、8690T、8457S、CST)，TLR4、TLR2一抗(批號(hào)分別為：A17436、A11225，Abclonal)，二抗(33101ES60，Yeasen/翊圣)。

1.3 儀器輻照儀(Multi Rad)；輪轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(Leica)；血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(邁瑞B(yǎng)C-5000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀)；光學(xué)顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus)；全自動(dòng)成像儀(ProteinSimple)。

1.4 方法

1.4.1動(dòng)物分組與AA模型建立 按隨機(jī)數(shù)字表法，將受體C57BL/6小鼠分為正常組(Control)、單純輻照組(TBI)、模型組(Model)、環(huán)孢素治療組(CsA)、PNS低劑量(PNS-L)、中劑量(PNS-M)、高劑量(PNS-H)組，每組7只。頸椎脫位法處死供體FVB小鼠，于體積分?jǐn)?shù)75%乙醇中浸泡5 min，無菌操作取頸部、腋下、腸系膜淋巴結(jié)及胸腺，加PBS緩沖液輕輕研磨后，200目篩網(wǎng)過濾，按胸腺細(xì)胞 ∶淋巴結(jié)細(xì)胞=1 ∶2制成淋巴細(xì)胞混懸液(濃度為2×1010·L-1)，臺(tái)盼藍(lán)測定細(xì)胞活性(活性>95%)。TBI組、模型組和給藥組小鼠經(jīng)5.0 Gy X-ray全身均勻照射，模型組和給藥組小鼠于輻照后4 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈輸入FVB小鼠淋巴細(xì)胞混懸液0.2 mL/只，含4×106個(gè)淋巴細(xì)胞。造模后d 1開始給藥，PNS低、中、高劑量組小鼠分別灌胃50、100、200 mg·kg-1的PNS，CsA治療組小鼠灌胃25 mg·kg-1的CsA，正常組、TBI組和模型組小鼠灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥/生理鹽水15 d。

1.4.2外周血細(xì)胞檢測與骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMCs)計(jì)數(shù) 在連續(xù)給藥或等劑量生理鹽水15 d后，摘眼球取血法收集外周血于EDTA抗凝管中，取0.2 mL外周血用全自動(dòng)細(xì)胞分析儀檢測外周血細(xì)胞中白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)數(shù)量。取右側(cè)股骨，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗骨髓腔直至股骨發(fā)白，留取骨髓細(xì)胞懸液，各組配平至同等體積，取0.2 mL細(xì)胞懸液裂解紅細(xì)胞后，自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)BMCs數(shù)量。

1.4.3骨髓病理學(xué)檢查 取小鼠胸骨浸泡于脫鈣液中至股骨軟化后，用自來水浸泡2 h后，置于4%多聚甲醛固定72 h，經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋、半薄切片及蘇木精-伊紅染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察各組骨髓病理學(xué)變化。

1.4.4體質(zhì)量變化情況、胸腺比、脾臟比 各組小鼠于造模后每2 d稱量體質(zhì)量，觀察體質(zhì)量變化情況，麻醉前稱重，處死后取小鼠脾臟和胸腺，分別稱量質(zhì)量，計(jì)算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4.5小鼠外周血清中IL-2、TNF-α、IL-10水平測定 小鼠摘眼球取血，EDTA抗凝管收集外周血，4 ℃、3 000 r·min-1離心15 min，收集上清，采用ELISA試劑盒檢測小鼠外周血清IL-2、TNF-α、IL-10水平，通過吸光度-濃度曲線計(jì)算質(zhì)量濃度，單位ng·L-1。

1.4.6骨髓中TLR4/TLR2-NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白檢測 取左側(cè)股骨，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗骨髓腔直至股骨發(fā)白，留取骨髓細(xì)胞懸液，4 ℃、1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀加入RIPA裂解液，4 ℃充分裂解20 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒檢測骨髓蛋白濃度，蛋白變性后各取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗膜后4 ℃孵育二抗2 h，TBST洗膜，ECL顯色在全自動(dòng)成像儀上曝光檢測條帶，用ImageJ軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況各組小鼠均無死亡，TBI組和模型組小鼠體質(zhì)量無明顯增加，表現(xiàn)為倦怠、食欲及精神狀態(tài)較差，活動(dòng)減少等，d 15，正常組和模型組小鼠出現(xiàn)明顯的平均體質(zhì)量差異(P<0.01)，見Fig 1。給藥前后相比，與正常組比較，模型組和PNS高劑量組小鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，PNS中劑量組小鼠體質(zhì)量增加明顯(P<0.05)；CsA組和PNS低劑量組小鼠體質(zhì)量一定程度增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PNS高劑量組小鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)。見Tab 2。

Fig 1 Mice body weight change curve over time ##P<0.01 vs Control group; *P<0.05 vs Model group.

2.2 各組小鼠外周血WBC、RBC、Hb、PLT水平及骨髓BMCs數(shù)量水平與正常組比較，TBI組和模型組小鼠外周血WBC、RBC、Hb、PLT及BMCs水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，PNS中劑量組小鼠外周血RBC、Hb、PLT水平明顯升高(P<0.05)，PNS各劑量組小鼠外周血WBC升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。PNS低、中、高劑量組小鼠BMCs數(shù)量均明顯升高(P<0.05)，CsA組小鼠BMCs水平增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同劑量PNS組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見Tab 1。

Tab 1 Number of WBC，RBC，HGB，PLT and BMCs levels of mice in various

Tab 2 Body weight change，body weight，spleen indexes and thymus indexes of mice in various

2.3 各組小鼠胸骨骨髓病理形態(tài)學(xué)變化正常組小鼠胸骨骨髓腔內(nèi)造血組織結(jié)構(gòu)完整，造血細(xì)胞分布均勻，未見明顯脂肪細(xì)胞，造血細(xì)胞增殖旺盛；TBI組和模型組小鼠骨髓有核細(xì)胞明顯減少，巨核細(xì)胞缺如，大量脂肪空泡代替造血細(xì)胞及組織。與模型組相比，CsA組和PNS各劑量組小鼠骨髓有核細(xì)胞均有不同程度增加，非造血組織面積減小；其中，中劑量的PNS對AA小鼠骨髓抑制情況改善程度最明顯。見Fig 2。

Fig 2 Bone marrow pathology in various groups (HE staining×200)A：Control group; B：TBI group; C：Model group; D：CsA treatment group; E：PNS low-dose group; F：PNS medium-dose group; G：PNS high-dose group.

Fig 3 Protein expression and quantitative analysis of CD11c，TLR4，TLR2，MyD88，NF-κB，Akt and MAPK in bone 1：Control group; 2：TBI group; 3：Model group; 4：CsA treatment group; 5：PNS low-dose group; 6：PNS medium-dose group; 7：PNS high-dose group. #P<0.05，##P<0.01 vs Control group; *P<0.05，**P<0.01 vs Model group.

2.4 各組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)變化與正常組比較，TBI組和模型組小鼠胸腺指數(shù)明顯降低(P<0.01)，模型組小鼠脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與TBI組相比，模型組小鼠脾臟指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，PNS中劑量組小鼠胸腺指數(shù)明顯升高(P<0.05)，PNS低、高劑量組胸腺指數(shù)升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；CsA組和PNS各劑量組脾臟指數(shù)均明顯降低(P<0.05),見Tab 2。

2.5 各組小鼠血清TNF-α、IL-2、IL-10水平與正常組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-2水平明顯升高(P<0.05)，IL-10水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，CsA組和PNS各劑量組小鼠外周血清IL-2水平均明顯降低(P<0.05)；CsA組和PNS中劑量組TNF-α明顯降低(P<0.05)，PNS低、高劑量組無明顯變化；CsA組和PNS高劑量組IL-10水平明顯升高(P<0.05)，PNS低、中劑量組IL-10升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與CsA組相比，PNS各劑量組IL-2水平明顯降低(P<0.05)，PNS各劑量組IL-10水平明顯升高(P<0.05)；隨著PNS劑量增加，PNS降低外周血清IL-2、TNF-α水平和升高IL-10水平均未見明顯劑量依賴性，見Tab 3。

Tab 3 Levels of IL-2，TNF-α and IL-10 in serum of

2.6 各組小鼠骨髓中CD11c及TLR4/TLR2-NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況與正常組相比，TBI組CD11c、TLR4、TLR2、NF-κB、Akt和模型組小鼠骨髓中CD11c、TLR4、TLR2、MyD88、NF-κB、Akt蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)；與TBI組相比，模型組CD11c表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，CsA組CD11c、TLR4、TLR2、Akt和PNS各劑量組小鼠骨髓中CD11c、TLR4、TLR2、NF-κB、Akt蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，但不同劑量PNS組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，并且MAPK蛋白表達(dá)無明顯變化；與陽性對照藥CsA組相比較，PNS治療后蛋白表達(dá)不存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見Fig 3。

3 討論

AA是一種致病因素多、致病機(jī)制復(fù)雜的難治性骨髓衰竭性疾病，闡明AA的致病機(jī)制和挖掘有效治療藥物對于其臨床診療具有重要意義。AA的主要特征是骨髓造血障礙和全血細(xì)胞減少，同時(shí)伴有免疫功能異常。既往研究表明，AA因各種因素出現(xiàn)骨髓造血缺陷，外周三系降低，機(jī)體貧血狀態(tài)可引起骨髓祖細(xì)胞大量遷出骨髓，在脾臟中聚集，導(dǎo)致脾臟增大，脾臟中紅細(xì)胞聚集和機(jī)體異常的免疫狀態(tài)也會(huì)進(jìn)一步加重貧血[10]，因此，脾臟腫大的程度可在一定程度上反映骨髓造血障礙和機(jī)體貧血水平。IL-2、TNF-α是具有抗造血作用的細(xì)胞因子[11]，研究表示AA患者骨髓上清液TNF-α、IL-2水平均升高，且骨髓中免疫亢進(jìn)和造血功能破壞程度和IL-2水平呈正相關(guān)；IL-10降低和Treg數(shù)量減少也參與AA的發(fā)生與發(fā)展[12]，均可作為檢驗(yàn)AA嚴(yán)重程度和治療預(yù)后的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，我們通過X射線輻照結(jié)合混合淋巴細(xì)胞輸注造模[13]15 d后，單純輻照和模型小鼠外周血三系、BMCs水平和胸腺指數(shù)明顯降低，骨髓正常造血組織破壞，另外，模型小鼠還表現(xiàn)出脾臟指數(shù)明顯升高，外周血清IL-2、TNF-α、IL-10水平紊亂等，表明我們成功建立免疫介導(dǎo)的AA小鼠模型，這與國內(nèi)外大量文獻(xiàn)報(bào)道相符[14]。

CD11c常作為DC的特異性標(biāo)記分子[15]，成熟的DC表面高表達(dá)CD11c，能提供T淋巴細(xì)胞活化所必須的信號(hào)分子，從而打破自身免疫耐受狀態(tài)，激發(fā)自身免疫反應(yīng)[16]。因此，CD11c表達(dá)水平在一定程度上能夠反映成熟DC的數(shù)量。TLR4作為經(jīng)典的模式識(shí)別受體之一，對于DC成熟活化和機(jī)體特異性免疫應(yīng)答都具有重要作用，TLR4可通過MyD88依賴途徑或TRIF依賴途徑，促進(jìn)Akt、MAPK生成，引起NF-κB釋放[17]，進(jìn)而參與造血功能調(diào)節(jié)和淋巴系及髓系等增殖分化，并調(diào)節(jié)多種造血調(diào)控因子的分泌，如IL-2、TNF-α等，TLR2與TLR4具有協(xié)同作用，TLR4/TLR2-NF-κB促炎信號(hào)通路的過度激活與AA造血障礙密切有關(guān)。那么PNS能否通過調(diào)節(jié)TLR4/TLR2-NF-κB信號(hào)通路從而減輕免疫介導(dǎo)AA小鼠骨髓免疫亢進(jìn)，值得深入探索。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單純輻照和模型小鼠均出現(xiàn)骨髓中CD11c及TLR4/TLR2-Akt-NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白過度表達(dá)，但免疫介導(dǎo)的AA模型小鼠CD11c、TLR2、MyD88蛋白表達(dá)增加更為明顯，且伴有外周血清細(xì)胞因子分泌紊亂，說明輻照和造模后都會(huì)引起免疫狀態(tài)異常，但AA模型小鼠免疫亢進(jìn)則更為明顯。給予PNS或CsA干預(yù)15 d后，骨髓造血組織和功能均有所恢復(fù)，外周血三系及BMCs水平升高，貧血狀態(tài)改善，血清細(xì)胞因子紊亂和脾臟腫大等免疫異常狀態(tài)有所改善，且PNS降低IL-2水平的效果優(yōu)于CsA。另外，PNS干預(yù)后，AA小鼠骨髓中CD11c、TLR4、TLR2、Akt、NF-κB蛋白表達(dá)明顯下降，而MyD88和MAPK無明顯下降，且其抑制作用與陽性對照藥CsA相當(dāng)。說明PNS對AA小鼠的治療作用，可能通過調(diào)節(jié)TLR4/TLR2-NF-κB信號(hào)通路部分蛋白的活化，而不依賴MyD88途徑，以及降低骨髓中成熟DC的數(shù)量，并改善IL-2、TNF-α等造血負(fù)調(diào)控因子水平，從而減輕異常免疫亢進(jìn)對造血干/祖細(xì)胞的破壞，緩解AA小鼠的造血功能。

綜上所述，PNS對免疫介導(dǎo)的AA小鼠模型骨髓破壞具有一定改善作用，并能減輕造血負(fù)調(diào)控因子的水平，使AA從免疫亢進(jìn)趨于免疫穩(wěn)態(tài)，其作用機(jī)制可能涉及對骨髓中TLR4/TLR2-Akt-NF-κB信號(hào)通路和專職抗原提呈細(xì)胞DC數(shù)量及活化的調(diào)控。