氯化兩面針堿通過PI3K/Akt/Bcl-2/caspase-3/PARP通路誘導小細胞肺癌細胞H1688和H446凋亡

于 菲，羅 卓，黎 驪，莫小香，沈小菊，莫孝成，譚惟丹，何敬川，鄧志華，陽 潔

(廣西醫科大學 1.藥學院，2.醫學科學實驗中心細胞與免疫實驗室，廣西 南寧 530021;3.廣西中醫藥研究院，廣西 南寧 530022)

小細胞肺癌作為惡性程度最高的肺部腫瘤，臨床上分為局限期和廣泛期，多數患者就診時已是廣泛期，難以進行手術治療、只能放化療[1]。順鉑作為臨床主要用藥(cisplatin，DDP)，與依托泊苷的聯合治療是SCLC一線治療的首選方案。但是，絕大多數患者易快速耐藥而復發[2]。目前針對非小細胞肺癌的特異性靶向藥對SCLC的治療反應欠佳，治療進展極為緩慢，因此，亟需發現新的SCLC治療靶點和藥物[3]。

兩面針(Zanthoxylumnitidum)是我國常用抗腫瘤壯藥，又名入地金牛、雙面刺、雙背針、山椒、下山虎等，為蕓香科花椒屬植物兩面針的干燥根，主產于廣西、福建、湖南、廣東、云南等地。據2020年版《中國藥典》記載其具有“行氣止痛，活血散瘀，通絡祛風等功效”，歸肝、胃經[4]。氯化兩面針堿是從兩面針的干燥根莖中提取的一種苯駢菲啶類生物堿，其化學結構如Fig 1所示[5]。研究表明氯化兩面針堿對乳腺癌、肝癌及鼻咽癌等多種惡性腫瘤具有抗腫瘤活性[6]，但目前對小細胞肺癌的研究甚少。因此，本研究以小細胞肺癌細胞H1688和H446為研究對象，將順鉑作為陽性對照藥，采用MTT法、流式細胞術檢測氯化兩面針堿對SCLC細胞活力和凋亡的影響；通過倒置顯微鏡和HE染色觀察氯化兩面針堿處理后細胞的形態學變化；通過蛋白免疫印跡法(Western blot)進一步探究氯化兩面針堿處理SCLC細胞后相關蛋白的表達變化，從而闡明氯化兩面針堿誘導SCLC發生凋亡的分子機制。

Fig 1 Chemical structure of nitidine chloride

1 材料與方法

1.1 細胞株SCLC 細胞株NCI-H1688、NCI-H446、NCI-H209來源于中國科學院細胞庫(中國上海)，NCI-H196來源于美國細胞培養收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，在 37℃、5%CO2的培養箱中培養；培養基為 RPMI1640，含有10%胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗。

1.2 藥物與試劑氯化兩面針堿，純度HPLC ≥ 98%，北京索萊寶公司，用二甲基亞砜(DMSO)配成1 g·L-1的貯存液；順鉑，齊魯制藥，用生理鹽水配成 1 g·L-1的貯存液；四甲基偶氮唑鹽(MTT)，北京索萊寶公司；胰酶粉末，北京索萊寶公司；青-鏈霉素雙抗，北京索萊寶公司；AnnexinV-PE/ 7-AAD凋亡試劑盒，聯科生物；伊紅，北京索萊寶公司；蘇木精，北京中杉新橋生物技術公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒，5×Loading buffer，雙色預染蛋白Marker(10 ku～250 ku)，上海雅酶生物醫藥科技有限公司；caspase-3、cleaved-caspase-3、p-Akt美國CST公司；Bax、Bcl-2、PARP(武漢Proteintech公司)；p-PI3K 北京博奧森公司。

1.3 主要儀器CO2培養箱，美國 Thermo 公司公司(3110)；細胞培養超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司(YJ-1360)；熒光倒置相差顯微鏡，日本 NIKON 公司(TS100-F)；多功能酶標儀，美國伯騰公司(SynergyH1)；FACS Calibur流式細胞儀，美國BD公司；雙色紅外成像系統(掃膜儀)，美國Licor公司(ODYSSEY)；低溫高速離心機，德國Eppendorf公司(5810R)。

1.4 方法

1.4.1MTT 法檢測氯化兩面針堿對SCLC細胞活性的影響 將H1688、H446、H196及H209細胞培養于25T細胞培養瓶，待細胞處于對數生長期時，用PBS洗2遍細胞，然后用0.25%胰酶進行消化，并進行細胞計數，分別制成單細胞懸液，將H1688、H446、H196及H209細胞分別以每孔3 000、5 000、3 000、3 000、20 000個/孔的細胞濃度接種于96孔板中，每孔細胞懸液100 μL，每個分組設置5個復孔，每組實驗重復3次。待24 h細胞貼壁后分別以0、0.5、1、2、4、8、16 μmol·L-1的氯化兩面針堿作用48 h以及0、2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1的順鉑作為陽性對照藥物組作用48 h后，每孔加入20 μL 0.5 mg·L-1的MTT，放入培養箱中孵育4 h后，小心吸去培養液，每孔加入150 μL DMSO，放置于搖床快速震蕩10 min后，在490 nm波長處用酶聯免疫檢測儀測吸光度值(OD)。計算細胞存活率：細胞存活率/%=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%。取平均值繪制藥物劑量效應曲線，通過SPSS計算藥物的半數抑制濃度(IC50)。本實驗中陰性對照組(Control)為0.1% DMSO。

1.4.2倒置顯微鏡及HE染色法觀察給藥前后H1688和H446細胞細胞核及細胞質的形態變化 將H1688和H446細胞用PBS清洗2遍，胰酶消化，計數，以1×105個·mL-1細胞接種到24孔板中，每孔細胞懸液500 μL，放入培養箱培養24 h。待24 h細胞貼壁后，給予對應濃度氯化兩面針堿或順鉑孵育，實驗分組情況同方法“2.4”部分表1。藥物處理48 h后，于倒置顯微鏡下觀察藥物處理后的細胞形態學變化并拍照；棄去培養基，用PBS洗滌2次，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗滌2次，每次1 min。蘇木精染色5 min，自來水洗滌。伊紅染色5 min，自來水洗滌，與倒置顯微鏡下觀察藥物處理后細胞核及細胞質的形態改變并拍照。

1.4.3流式細胞術檢測氯化兩面針堿對H1688 和H446細胞凋亡的影響 按 AnnexinV-PE/ 7-AAD cell apoptosis 試劑盒說明書操作，主要步驟為：取對數生長期的H1688和H446 細胞，調整細胞密度，以2×105個/孔接種于6孔板中，待細胞完全貼壁后采用氯化兩面針堿低濃度組、氯化兩面針堿高濃度組、順鉑組及DMSO對照組分別處理細胞，實驗分組情況同方法“2.4”部分Tab 1。繼續培養48 h后，用不含EDTA的0.25%胰酶消化，用離心管收集各組細胞，800 r·min-1離心5 min，棄去上清，用預冷PBS重懸離心洗滌，800 r·min-1離心5min，棄去上清，留細胞沉淀，加入400 μL 1×Binding buffer 工作液，吹打混勻后轉移細胞混懸液至流式管，每管加入5 μL AnnexinV-PE 和 5 μL 7-AAD混勻后，室溫避光孵育15 min，在流式細胞儀上進行檢測分析。

1.4.4MTT法檢測凋亡抑制劑Z-VAD-FMK對氯化兩面針堿或順鉑對 SCLC 細胞株H1688、H446細胞活力的影響 取對數生長期的H1688和H446細胞，分別以每孔3 000、5 000個/孔接種于96孔板，待細胞貼壁24 h后，吸走培養液上清后，依次向每孔加入含有藥物RPMI1640完全培養基溶液100 μL，實驗分組和加藥濃度如Tab 1和Tab 2，每個濃度設置5個復孔，每組實驗重復3次。繼續培養48 h后，往每孔加入20 μL 0.5 mg·L-1的MTT，放入培養箱中孵育4 h后，小心吸去培養液，應盡量避免吸到紫色結晶沉淀，每孔加入150 μL DMSO，放置于搖床快速震蕩10 min后，在490 nm波長處用酶聯免疫檢測儀測吸光度值(OD)。計算細胞存活率：細胞存活率/%=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(對照組OD值-空白孔OD值)×100%。

Tab 1 Experimental grouping and concentration-nitidine chloride or cisplatin

Tab 2 Experimental grouping and concentration-nitidine chloride/cisplatin + Z-VAD-FMK

1.4.5Western blot法檢測SCLC細胞內Bax、Bcl-2、PARP、cleaved PARP、caspase-3、cleaved-caspase-3、p-Akt蛋白表達水平 細胞處理及給藥方法同方法“2.3部分”，實驗分組情況同方法“2.4”部分Tab 1。細胞用藥物處理48 h后，收集舊培養基，用PBS洗滌2次，胰酶消化，收集細胞，800 r·min-1，離心5 min。根據細胞數加入適量的1×RIPA buffer裂解(含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑)，冰上裂解30 min后，用細胞刮收集蛋白，12 000×g離心30 min后吸取上清，用 BCA 法檢測蛋白濃度后，按比例加入5×Loading buffer，100 ℃水浴孵育5 min使蛋白變性。根據待檢測蛋白的分子量大小，制備12.5%的聚丙烯酰胺凝膠，取30 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完成后轉膜。在5%脫脂奶粉中常溫封閉1 h，加入一抗溶液在4 ℃下孵育過夜，d 2回收一抗，用PBST緩沖液洗滌3次后，加入抗兔或鼠IgG二抗溶液，在室溫下孵育1 h，PBST緩沖液洗滌3次。將PVDF膜置于Odyssey紅外熒光成像系統中，按照儀器說明進行掃描，結果以ImageJ軟件進行測量分析。

2 結果

2.1 氯化兩面針堿可呈濃度依賴性地抑制人 SCLC 細胞株 H1688、H446、H196、H209的活力結果如Fig 2所示，隨著氯化兩面針堿濃度(0、0.5、1、2、4、8、16 μmol·L-1)的升高，H1688、H446、H196和H209的細胞活力逐漸降低，表明氯化兩面針堿可呈濃度依賴性地抑制SCLC細胞活力。如Tab 3所示，氯化兩面針堿或順鉑作用于H1688細胞48 h的IC50分別為(1.52±0.08)、(16.93±1.51) μmol·L-1，H446細胞分別為(1.99±0.21)、(16.72±1.70) μmol·L-1，H196細胞分別為(4.65±0.57)、(16.22±1.73) μmol·L-1以及H209細胞分別為(3.26±0.09)、(35.02±1.85) μmol·L-1。以上結果表明，相比順鉑(16.2～35.0 μmol·L-1)氯化兩面針堿以更小的劑量(1.5～4.6 μmol·L-1)抑制SCLC 細胞活力。其中氯化兩面針堿對H1688和H446細胞的體外抑制效果更好，因此，我們選擇H1688和H446細胞進行相關機制研究。用SPSS軟件計算得到氯化兩面針堿處理H1688細胞48 h的IC20和IC60分別為0.5和1 μmol·L-1，對H446細胞48 h的IC20和IC60分別為0.75和1.5 μmol·L-1。因此我們選擇0.5和1 μmol·L-1作為H688細胞后續實驗的條件，選擇0.75和1.5 μmol·L-1作為H446細胞后續實驗的條件，陽性對照藥物順鉑組我們統一選擇15 μmol·L-1作為兩株細胞后續實驗的條件進行研究。

Fig 2 Effect of nitidine chloride on activity of human SCLC cell lines H1688, H446, H196,

Tab 3 Comparison of 48 h IC50 of human SCLC cell lines H1688, H446, H196 and H209 treated with nitidine chloride or cisplatin ，n=3)

2.2 氯化兩面針堿呈劑量依賴性誘導 H1688和H446 細胞出現凋亡形態特征結果如Fig 3所示，0.1%DMSO處理的陰性對照組(Control)H1688細胞呈菱形，H446細胞呈卵圓形、三角形，細胞大小均勻一致，細胞膜完整，分裂狀態正常。與陰性對照組(Control)相比，用15 μmol·L-1DDP處理的H1688和H446細胞出現細胞皺縮，部分細胞呈長梭形，胞膜上有小泡狀形成，呈現出凋亡形態特征。與陽性對照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，隨著氯化兩面針堿濃度的增加，凋亡細胞增多。以上結果表明，氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地誘導SCLC細胞出現凋亡形態特征。

Fig 3 Density and morphological changes of cells in each group observed by inverted fluorescence microscope

結果如Fig 4所示，0.1%DMSO處理的陰性對照組(Control)細胞胞質呈紅紫色，胞核呈深紫色，細胞形態完整，胞質較豐富且無明顯變化；與陰性對照組(Control)相比，用15 μmol·L-1DDP處理的H1688和H446細胞胞質密度下降，細胞質減少，部分細胞出現皺縮，細胞核邊集。與陽性對照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，隨著氯化兩面針堿濃度的增加，H1688細胞和H446細胞出現胞漿流失，細胞核固縮、邊集化現象。以上結果表明，氯化兩面針堿可能誘導SCLC細胞發生凋亡。

Fig 4 The morphological changes of cells observed by HE staining in each group after treatment with nitidine chloride

2.3 氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地升高H1688 和H446細胞凋亡率結果如Fig 5所示，與0.1%DMSO處理的陰性對照組(Control)比較，用陽性對照藥物順鉑處理H1688和H446細胞后，細胞凋亡率升高。與陽性對照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，隨著氯化兩面針堿濃度的增加，氯化兩面針堿處理的H1688和H446細胞凋亡率顯著升高。以上結果表明，氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地誘導SCLC細胞發生凋亡。

Fig 5 The apoptotic rate of H1688 and H446 cells increased by nitidine chloride in a dose-dependent ，n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs Control

2.4 氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地激活H1688 和H446細胞caspase-3和PARP蛋白表達結果如Fig 6所示，與0.1%DMSO處理的陰性對照組(Control)比較，用陽性對照藥物順鉑處理H1688和H446細胞后，H1688和H446細胞cleaved-caspase-3和cleaved PARP蛋白表達均明顯升高。與陽性對照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，氯化兩面針堿1 μmol·L-1處理的H1688細胞cleaved caspase-3蛋白表達明顯升高，氯化兩面針堿0.5、1μmol·L-1處理的H1688細胞cleaved PARP蛋白表達明顯升高；氯化兩面針堿0.75、1.5 μmol·L-1處理的 H446細胞cleaved-caspase-3和cleaved PARP蛋白表達明顯升高。以上結果表明，氯化兩面針堿可激活H1688和H446細胞caspase-3和PARP蛋白表達。

Fig 6 Caspase-3 and PARP protein expression in H1688 and H446 cells activated by nitidine chloride in a dose-dependent ，n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs Control

2.5 氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地升高H1688和H446細胞Bax表達，降低Bcl-2蛋白表達Bcl-2家族作為caspase-3的上游調節信號，可作為凋亡信號的開關誘導細胞發生凋亡。其中，Bax/Bcl-2比值通常可作為細胞抗凋亡能力的評判指標[7]。結果如Fig 7所示，與0.1%DMSO處理的陰性對照組(Control)對照組比較，用15 μmol·L-1DDP處理H1688和H446細胞后，兩株細胞的Bax/Bcl-2蛋白表達比值明顯升高。與陽性對照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，隨著氯化兩面針堿濃度的增加，H1688和H446細胞Bax/Bcl-2蛋白表達比值明顯升高。以上結果表明，氯化兩面針堿可升高H1688和H446細胞Bax表達、降低Bcl-2蛋白表達。

Fig 7 Ratio of Bax/Bcl-2 protein expression in H1688 and H446 cells increased by nitidine chloride in a dose-dependent manner *P<0.05，**P<0.01 vs Control

2.6 凋亡抑制劑Z-VAD-FMK對氯化兩面針堿或順鉑誘導H1688和H446細胞凋亡的影響凋亡抑制劑Z-VAD-FMK能以不可逆的形式與活化的半胱氨酸蛋白酶caspases結合，從而阻斷細胞凋亡。結果如Fig 8所示，與單用氯化兩面針堿或順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)比較，當凋亡抑制劑Z-VAD-FMK分別與氯化兩面針堿或順鉑聯用時，可部分拮抗氯化兩面針堿或順鉑對H1688和H446細胞凋亡的誘導作用。以上結果表明，氯化兩面針堿對H1688和H446細胞凋亡的抑制作用可被凋亡抑制劑Z-VAD-FMK部分拮抗；結合“3.4”部分的結果，我們推測氯化兩面針堿可誘導人SCLC細胞發生caspases酶依賴的細胞凋亡。

Fig 8 Effect of apoptosis inhibitor Z-VAD-FMK on apoptosis of H1688 and H446 cells induced by nitidine chloride or A：Nitidine chloride 0.5 μmol·L-1; B:Nitidine chloride 1 μmol·L-1; C:DDP 15 μmol·L-1; D:Z-VAD-FMK 10 μmol·L-1; E:Nitidine chloride 0.75 μmol·L-1; F:Nitidine chloride 1.5 μmol·L-1. *P<0.05，**P<0.01 vs the Single drug group

2.7 氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地抑制H1688 和H446細胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達Akt作為PI3K/Akt信號通路中的主要功能靶點激酶，可作為Bcl-2蛋白的上游信號分子，并通過磷酸化Bcl-2進而激活其下游的caspase-3[8]。如Fig 9所示，與0.1%DMSO處理的陰性對照組(Control)比較，用DDP 15 μmol·L-1處理后H1688和H446細胞p-PI3K和p-Akt水平降低。與陽性對照藥物順鉑組(DDP 15 μmol·L-1)相似，隨著氯化兩面針堿濃度的增加，H1688和H446細胞p-PI3K和p-Akt水平顯著降低。以上結果表明，氯化兩面針堿可呈劑量依賴性地抑制H1688和H446細胞p-PI3K和p-Akt蛋白表達。

Fig 9 Expression of p-PI3K and p-Akt protein in H1688 and H446 cells inhibited by nitidine chloride in a dose-dependent *P<0.05，**P<0.01 vs Control

3 討論

SCLC因其具有早期轉移傾向、快速分裂、免疫逃逸、躲避凋亡等特點，導致臨床極差的預后[9]。順鉑作為SCLC的一線化療藥，由于順鉑毒性大、不良反應較多，限制了其臨床應用和療效[10]。因此，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物是腫瘤藥理學領域研究的熱點和難點。本研究中通過將順鉑作為陽性對照藥與氯化兩面針堿進行比較研究發現，氯化兩面針堿能以更小的劑量(5 μmol·L-1)誘導SCLC細胞發生凋亡，提示其可作為一種更高效的具有抗SCLC潛力的藥物。

包括民族藥在內的中草藥是我國傳統醫藥和創新藥物研發的寶貴資源，許多中藥及其有效成分具有良好的抗腫瘤活性。氯化兩面針堿作為一種中藥單體已被證明具有較強的抗非小細胞肺癌活性，其作用機制主要是通過下調Hippo通路相關蛋白MOB-1、LATS-1、YAP的表達從而產生抗NSCLC作用[11]。而氯化兩面針堿能否通過誘導凋亡來發揮抗SCLC作用，目前仍不清楚。本文旨在研究氯化兩面針堿作用于小細胞肺癌的機制。

我們通過HE染色和流式細胞術發現，與順鉑相似，氯化兩面針堿可誘導SCLC細胞發生凋亡的形態學改變，細胞數量明顯減少并升高凋亡率。caspase-3作為細胞凋亡的執行者，其被激活后，在大量自由基和氧化劑存在的情況下會激活聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly ADP-ribose polymerase 1，PARP-1)，引起ATP的過度消耗，誘導細胞發生凋亡[12]。Bcl-2家族作為凋亡信號通路的開關，可激活caspase-3，誘導細胞發生凋亡。本研究中我們通過Western blot實驗發現,氯化兩面針堿可升高Bax并抑制Bcl-2，使cleaved-caspase-3及PARP的表達增加，提示氯化兩面針堿對H1688和H446細胞的促凋亡作用可能與調控Bcl-2家族蛋白表達，激活caspase-3及PARP有關。

PI3K/Akt通路與腫瘤發生發展密切相關，目前針對這一信號通路已有臨床研究正在開展，如目前正在開展臨床Ⅰ期實驗的PI3K抑制劑BKM120，與順鉑和依托泊苷聯用可延緩耐藥的發生；正在開展臨床Ⅱ期實驗的Akt抑制劑MK-2206，可應用于小細胞肺癌、非小細胞肺癌和胸腺等惡性腫瘤[13]。近年來研究表明，具有抗腫瘤活性的中藥活性成分或單體可通過調控PI3K/Akt通路誘導腫瘤細胞凋亡。有研究發現，藍萼甲素可通過抑制PI3K和Akt的磷酸化來誘導三陰性乳腺癌細胞發生凋亡來發揮抗腫瘤作用[14]。本實驗中，我們發現氯化兩面針堿可抑制PI3K和Akt的磷酸化，因此,我們推測氯化兩面針堿誘導SCLC發生的凋亡可能與抑制PI3K和Akt的磷酸化，升高Bax的表達，抑制Bcl-2進而激活caspase-3及PARP有關。

值得注意的是，抗凋亡抑制劑Z-VAD-FMK并不能完全拮抗氯化兩面針堿或順鉑誘導的細胞死亡。研究表明，順鉑除了可誘導腫瘤細胞發生凋亡外，還能誘導腫瘤細胞發生鐵死亡[15]、焦亡[16]、程序性壞死[17]等死亡方式來發揮抗癌作用。中藥包括中藥活性單體具有多靶點、多環節、多途徑的抗癌特性，可誘導細胞發生凋亡、壞死、焦亡、鐵死亡、脹亡等多種死亡方式來發揮抗癌作用[18]。近年來，鐵死亡、焦亡、壞死、自噬性死亡等多種非凋亡性死亡的發現為闡明腫瘤發生發展機制和抗癌藥物的研究提供了新思路和新的治療靶點。目前,關于氯化兩面針堿引起細胞發生除凋亡外的其他死亡方式鮮有報道。因此，我們推測氯化兩面針堿除了誘導凋亡，還可能通過誘導細胞發生其他死亡來發揮抗SCLC作用。

綜上所述，氯化兩面針堿可誘導SCLC細胞發生凋亡，其機制可能與抑制PI3K和Akt 的磷酸化，升高Bax、抑制Bcl-2的表達進而激活caspase-3及PARP有關。我們還將進一步研究氯化兩面針堿是否還通過誘導其他死亡方式發揮抗腫瘤作用及其具體機制，從而為廣西特色抗腫瘤民族藥的開發和利用提供新的依據和思路。