香葉木素預(yù)處理通過(guò)抗炎和抗氧化發(fā)揮對(duì)小鼠肝缺血/再灌注的保護(hù)作用

余 偉，黃長(zhǎng)山，丁月超，黃 濤，馬 超，張 鍇，王 謙

(鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽胰外科，河南 鄭州 450008)

肝缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)是肝臟手術(shù)或肝移植的必要組成部分，在缺血過(guò)程中不可避免地會(huì)導(dǎo)致肝損傷，再灌注后肝功能也不太可能迅速恢復(fù)正常，且還會(huì)增加肝損傷[1]。在大多數(shù)情況下，肝臟手術(shù)后會(huì)出現(xiàn)炎癥和損傷，甚至嚴(yán)重的肝功能障礙；嚴(yán)重的肝I/R損傷還可能導(dǎo)致多器官衰竭甚至死亡[2]。因此，探索能減輕肝I/R損傷的策略對(duì)改善患者預(yù)后和降低死亡率具有重要意義。

肝I/R損傷涉及復(fù)雜的生理過(guò)程，如代謝紊亂、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等[3]。香葉木素[diosmetin，Dio，5,7-二羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)-4-苯并吡喃酮，C16H12O6]是一種具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等多種活性的黃酮類化合物。Dio已被報(bào)道可減輕心臟、腎臟和其他臟器的I/R損傷[4-6]，且在脂多糖、對(duì)乙酰氨基酚等誘導(dǎo)的肝損傷小鼠模型中其能發(fā)揮肝保護(hù)作用[7-8]。據(jù)此推測(cè)Dio可能也具有抗肝I/R損傷的功能。而，Dio對(duì)肝I/R損傷的作用和機(jī)制仍不完全清楚。因此，本研究觀察Dio是否對(duì)肝I/R損傷發(fā)揮有益作用并探討相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑香葉木素(Dio；貨號(hào)：465944，北京百靈威科技有限公司)；小鼠白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β(貨號(hào)：3748)、IL-6(貨號(hào)：4355)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)(貨號(hào)：10257)和乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)(貨號(hào)：12240)ELISA檢測(cè)試劑盒(均為江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：A003-1-2)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：E004-1-1)、還原性谷胱甘肽(reduced glutathione，GSH)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：A006-2-1)和總膽紅素(total bilirubin，TBIL)測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：C019-1-1)(均為南京建成生物工程研究所)；改良Lowry法蛋白定量試劑盒(貨號(hào)：BTN101102)、RIPA裂解液(貨號(hào)：BTN131007)、蘇木精伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)試劑盒(貨號(hào)：YT165)和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(HRP-Streptavidin；貨號(hào)：YT371)(均為北京百奧萊博科技有限公司)；SP免疫組織化學(xué)試劑盒(貨號(hào)：SP0041)和West Pico ECL超敏發(fā)光液(貨號(hào)：PE0020)(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；IL-1β抗體(貨號(hào)：WLH3903)、caspase-3抗體(貨號(hào)：WL04004)、cleaved-caspase-3抗體(貨號(hào)：WL01992)、p38抗體(貨號(hào)：WL00764)、p-p38抗體(貨號(hào)：WL03428)和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號(hào)：WLA023)(均為萬(wàn)類生物科技有限公司)；核因子(nuclear factor，NF)-κB p65抗體(貨號(hào)：8242)和p-NF-κB p65抗體(貨號(hào)：3033)(美國(guó)CST公司)；GAPDH抗體(貨號(hào)：BA2913)(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂ SPF級(jí)C57BL/6J小鼠(6-7周，19～22 g)購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(豫)2017-0001)。小鼠被安置在鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境動(dòng)物房[每籠不超過(guò)5只小鼠，21 ℃～23 ℃，55%～65%濕度，12 h光照/黑暗周期，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(豫)2020-0008]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中國(guó)動(dòng)物保健和使用委員會(huì)的指南進(jìn)行，并經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)機(jī)構(gòu)動(dòng)物保健和使用委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2019-564)。

1.3 儀器顯微鏡(IX53；日本Olympus公司)；酶標(biāo)分析儀(DNM-9606；北京普朗新技術(shù)有限公司)；熒光酶標(biāo)儀(SpectraMax Gemini EM；美國(guó)Molecular Devices公司)；全自動(dòng)蛋白印跡處理系統(tǒng)(WB-600Auto；廣州博鷺騰生物科技有限公司)；eBlot接觸式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(eBlot Touch Imager；上海易孛特光電技術(shù)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1小鼠肝I/R損傷模型及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，將32只小鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)(Sham)組、I/R組、低劑量Dio組和高劑量Dio組，每組8只。I/R組按照Yang等[9]的方法，用異氟醚麻醉后，解剖腹部并用一個(gè)創(chuàng)傷性?shī)A穿過(guò)門靜脈三聯(lián)體阻斷70%肝動(dòng)脈/門靜脈血液，并于缺血1 h后，取出夾子行再灌注。Sham組除不進(jìn)行肝I/R手術(shù)外，其余手術(shù)步驟同I/R組。低和高劑量Dio組行肝I/R手術(shù)前30 min分別通過(guò)腹腔注射10 mg·kg-1和40 mg·kg-1Dio，Sham組和I/R組通過(guò)腹腔注射等體積的含2% DMSO的生理鹽水。再灌注后24 h，用異氟醚麻醉小鼠，采集各組小鼠的血液和肝臟樣本。

1.4.2HE染色與組織學(xué)分析 肝組織樣品在4%多聚甲醛中固定48 h后，并用石蠟包埋。石蠟包埋的肝組織切為5 μm厚的連續(xù)石蠟切片后，依次經(jīng)脫蠟、水合后，用HE染色。兩名研究人員按照Yang等[9]的方法使用光學(xué)顯微鏡以盲法評(píng)估組織學(xué)情況。

1.4.3ELISA法檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6、LDH和AST的水平 根據(jù)制造商的說(shuō)明，分別采用對(duì)應(yīng)的試劑盒進(jìn)行ELISA反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm處讀取樣品的吸光度值，并根據(jù)各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中IL-1β、IL-6、LDH和AST的水平。

1.4.4試劑盒法檢測(cè)肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)和TBIL的水平 將肝組織用冰PBS按照1 ∶9進(jìn)行勻漿，3 600×g離心收集肝組織勻漿液。用改良Lowry法蛋白定量試劑盒測(cè)定肝組織勻漿液中蛋白含量。根據(jù)制造商的說(shuō)明，用硫代巴比妥酸法(酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)530 nm處讀取樣品的吸光度值)測(cè)量肝組織勻漿液中MDA含量，用化學(xué)熒光法(熒光酶標(biāo)儀在發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處讀取樣品的熒光度值)測(cè)量肝組織勻漿液中ROS含量，用二硫代二硝基苯甲酸法(酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)405 nm處讀取樣品的吸光度值)測(cè)量肝組織勻漿液中GSH含量，用亞硝酸鈉氧化法(酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處讀取樣品的吸光度值)測(cè)量肝組織勻漿液中TBIL含量。肝組織中上述氧化應(yīng)激指標(biāo)水平=肝組織勻漿液中上述氧化應(yīng)激指標(biāo)含量/肝組織勻漿液中蛋白含量。

1.4.5免疫組織化學(xué)染色觀察肝組織中IL-1β的表達(dá) 取肝組織切片(5 μm厚)，常規(guī)脫蠟、水合、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶和封閉后，按照常規(guī)SP法程序依次孵育IL-1β抗體(1 ∶250稀釋)、Bio-山羊抗兔IgG(1 ∶200稀釋)和HRP-Streptavidin(1 ∶200稀釋)后，用DAB顯色，蘇木精復(fù)染，在顯微鏡下觀察染色情況。

1.4.6Western blot檢測(cè)肝組織中cleaved-caspase-3、p-NF-κB p65和p-p38蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取蛋白，用改良Lowry法對(duì)蛋白定量后，用全自動(dòng)蛋白印跡處理系統(tǒng)對(duì)上樣的蛋白進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)、封閉和抗體孵育。其中，caspase-3、NF-κB p65、p38和GAPDH抗體的稀釋比例均為1 ∶5 000，cleaved-caspase-3、p-NF-κB p65、p-p38和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)的稀釋比例均為1 ∶1 000。用West Pico ECL超敏發(fā)光液和eBlot接觸式化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)對(duì)蛋白進(jìn)行顯像并分析相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 Dio預(yù)處理減輕肝I/R損傷HE染色(Fig 1A)顯示，Sham組肝組織基本正常，I/R組肝組織出現(xiàn)大面積壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；低、高劑量Dio組由肝I/R誘導(dǎo)的病理改變得到明顯緩解。H&E染色量化數(shù)據(jù)(Fig 1B和1C)顯示，與Sham組相比，I/R組肝組織壞死面積和組織學(xué)評(píng)分均明顯增加(P<0.01)；施用Dio預(yù)處理明顯減小了肝I/R后的壞死面積和肝損傷評(píng)分(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組效果更為明顯。ELISA結(jié)果(Fig 1D和1E)顯示，肝I/R后血清LDH和AST水平明顯升高(P<0.01)，施用Dio預(yù)處理能明顯降低肝I/R誘導(dǎo)的血清LDH和AST水平(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組效果更為明顯。同時(shí)，Western blot結(jié)果(Fig 1F和1G)顯示，肝I/R后肝組織中cleaved-caspase-3表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)，施用Dio預(yù)處理能明顯降低肝I/R誘導(dǎo)的肝組織中cleaved-caspase-3表達(dá)(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組效果更為明顯。

Fig 1 Effect of Dio pretreatment on liver injury after liver I/RA: Representative images of H&E staining (scale bar=50 μm); B: Statistical results of necrotic area; C: Statistical results of liver histological score; D: The level of LDH in serum; E: The level of AST in the serum; F and G: cleaved-caspase-3 expression in liver tissues was detected by Western blot n=8); #P<0.01 vs Sham group; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

2.2 Dio預(yù)處理改善肝I/R后的肝功能并降低氧化應(yīng)激和促炎因子水平氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果(Fig 2A-2C)顯示，與Sham組相比，I/R組肝組織中MDA和ROS水平明顯增加(P<0.01)，GSH水平明顯降低(P<0.01)；與I/R組相比，低、高劑量Dio組肝肝組織中MDA和ROS水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，GSH水平明顯增加(P<0.05或P<0.01)，且高劑量組變化更為明顯；說(shuō)明Dio預(yù)處理能抑制肝I/R誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。TBIL檢測(cè)結(jié)果(Fig 2D)顯示，低、高劑量Dio預(yù)處理均能部分逆轉(zhuǎn)肝I/R導(dǎo)致肝組織中TBIL水平增加(P<0.05或P<0.01)，提示Dio預(yù)處理改善肝I/R后的肝功能受損。同時(shí)，促炎因子檢測(cè)結(jié)果(Fig 3)顯示，低、高劑量Dio預(yù)處理均能部分逆轉(zhuǎn)肝I/R導(dǎo)致肝組織和血清中IL-1β水平以及血清中IL-6水平升高，Dio預(yù)處理減輕肝I/R后的肝部炎癥。

Fig 2 Effect of Dio pretreatment on oxidative stressand liver function after liver I/RA:The level of MDA in the liver; B: The level of ROS in the liver; C: The level of GSH in the liver; D: The level of TBIL in the liver n=8); #P<0.01 vs Sham group; *P<0.05,**P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

Fig 3 Effect of Dio pretreatment on inflammatory factors after liver I/RA: The expression and distribution of IL-1β in liver (scale bar=50 μm); B: The level of IL-1β in serum; C: The level of IL-6 in serum n=8); #P<0.01 vs Sham group; *P<0.05, **P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

2.3 Dio預(yù)處理對(duì)NF-κB及p38通路的影響Western blot結(jié)果(Fig 4)顯示，與Sham組相比，I/R組肝組織中NF-κB p65和p38的磷酸化水平明顯增加(P<0.01)；與I/R組相比，低、高劑量Dio組肝肝組織中NF-κB p65和p38的磷酸化水平明顯降低(P<0.01)，且高劑量組變化更為明顯；說(shuō)明Dio預(yù)處理能抑制肝I/R誘導(dǎo)的NF-κB和p38的活化。

Fig 4 Effect of Dio pretreatment on activation of NF-κB and p38 after liver I/RA: Western blot electrophoretogram of NF-κB p65, p-NF-κB p65, p38, and p-p38 protein expression in liver tissue; B: Relative expression level of p-NF-κB p65/NF-κB p65; C: Relative expression level of p-NF-κB p65/NF-κB p65 n=8); #P<0.05 vs Sham group; **P<0.01 vs I/R group; △P<0.05 vs Low Dio group.

3 討論

肝I/R損傷對(duì)肝臟手術(shù)或肝移植患者的預(yù)后有嚴(yán)重的不良影響[2]，而目前并沒(méi)有很好的預(yù)防或治療辦法。本研究以小鼠肝I/R模型探討了Dio預(yù)處理對(duì)I/R后肝損傷的影響，結(jié)果表明，Dio預(yù)處理可降低I/R后的肝損傷，提示，Dio是潛在的對(duì)抗I/R后肝損傷的防護(hù)劑。

氧化應(yīng)激在肝I/R損傷的整個(gè)病理生理過(guò)程發(fā)揮重要作用。在肝I/R過(guò)程中，ROS的大量積聚是I/R后導(dǎo)致肝損傷的啟動(dòng)和發(fā)展的重要因素[10]，同時(shí)如SOD和GSH等抗氧化酶耗竭并導(dǎo)致清除氧自由基的能力降低[10-11]，造成肝組織氧化損傷。脂質(zhì)過(guò)氧化物終產(chǎn)物MDA可在一定程度上反映組織氧化損傷程度[10-11]。本研究顯示，Dio預(yù)處理能降低肝I/R小鼠肝組織中ROS和MDA水平，并能增加清除氧自由基的能力(GSH水平增加)，從而減輕氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激也可啟動(dòng)肝I/R后的炎癥和細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象。炎癥參與肝I/R損傷的整個(gè)病理生理過(guò)程，其中，炎癥因子的相互作用導(dǎo)致肝臟中炎性細(xì)胞的募集和浸潤(rùn)，加劇了炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[12]。已有研究表明，IL-1β和IL-6的上調(diào)可通過(guò)加重炎癥反應(yīng)直接導(dǎo)致肝損傷[13-14]。本研究證實(shí)了Dio預(yù)處理能降低肝I/R小鼠的IL-1β和IL-6水平，并降低了肝損傷指標(biāo)LDH、AST和TBIL以及改善肝臟組織學(xué)形態(tài)表現(xiàn)。此外，凋亡是I/R損傷過(guò)程中的一種常見(jiàn)現(xiàn)象，據(jù)報(bào)道，在肝I/R期間，約50%～70%的內(nèi)皮細(xì)胞和40%～60%的肝細(xì)胞經(jīng)歷了凋亡[15]。因此，有效阻斷細(xì)胞凋亡是減輕肝損傷和維持肝功能的重要途徑之一。本研究觀察到Dio預(yù)處理明顯降低了肝I/R小鼠肝組織中cleaved-caspase-3的表達(dá)，提示，Dio預(yù)處理能降低I/R后肝組織中細(xì)胞凋亡。

本研究進(jìn)一步對(duì)Dio預(yù)處理發(fā)揮肝I/R后的肝保護(hù)的作用機(jī)制進(jìn)行了探索。眾所周知，肝I/R損傷進(jìn)程中，NF-κB活化后，啟動(dòng)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，抑制NF-κB活化可減輕肝I/R損傷[16-17]。本研究也觀察到肝I/R可上調(diào)p-NF-κB p65的表達(dá)，相反，Dio預(yù)處理可明顯降低其表達(dá)；說(shuō)明Dio預(yù)處理可減弱肝I/R后肝組織中NF-κB活化。此外，p38激活與白細(xì)胞募集和激活的啟動(dòng)有關(guān)，其并能進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞損傷[18]。本項(xiàng)研究的結(jié)果表明，Dio預(yù)處理能抑制肝I/R后肝組織中p38的磷酸化。

總之，本結(jié)果顯示Dio預(yù)處理可減輕肝I/R損傷，且這一作用可能與減弱NF-κB和p38活化以及氧化應(yīng)激有關(guān)。并且，本實(shí)驗(yàn)還提示了，Dio可能是一種潛在用于抗肝I/R損傷的肝防護(hù)劑。