一株豬鏈球菌2型的分離與鑒定

江 波 楊 蓉

（樂山市夾江縣動物疫病預防控制中心，四川樂山 614100）

豬鏈球菌(Streptococcus Suis,SS)屬于乳酸桿菌目、鏈球菌科、乳球菌屬,是一種不運動、有莢膜、無鞭毛的革蘭氏陽性兼性厭氧菌,該細菌對培養條件要求較嚴格,在含血液或血清的培養基上生長較好,單個菌落直徑0.1～1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊[1]。根據溶血情況不同,可分為α溶血、β溶血、γ溶血。α溶血致病力弱,菌落周圍形成草綠色溶血環；β溶血致病力強,菌落周圍呈完全透明溶血環；γ溶血無致病性、無溶血現象。

按莢膜多糖(CPS)特異性差異,將SS分為35個血清型,即1/2型和1～34型[2]。現在公認的血清型中,1、2、7、9型都是豬的致病菌,其中2型豬鏈球菌致病力最強,是一種重要的人畜共患病病原[3]。鏈球菌在全球分布廣泛,最早在荷蘭和英國被報道,在我國四川、廣西、上海等省份廣泛流行,給人體健康和公共衛生安全帶來了極大的威脅。該病主要導致豬出現腦膜炎、關節炎、敗血癥及化膿性淋巴結炎等[4],并且還能引起人類感染胸膜炎、腦膜炎、敗血癥等,甚至死亡[5,6]。此外,該病原常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductiveandrespiratory,PRRSV)、豬圓環病毒(Porcine circovirus type 2,PCV-2)等混合感染。2021年10月四川某豬場部分仔豬出現磨牙、轉圈、四肢劃水等神經癥狀,關節腫脹、跛行、體溫普遍升高,發病豬部分出現死亡。對該豬場病豬進行病料采集,細菌分離純化、革蘭氏染色、16S rRNA基因擴增測序、血清型確定和藥敏試驗等確定致病菌的性狀,為豬場疾病的防治提供科學的參考依據。

1 試驗材料

1.1 病料采集

試驗用病料采集于四川省某發病豬場病豬。

1.2 試驗動物

健康小白鼠(約20 g/只)購于成都達碩實驗動物有限公司,試驗前先置于室內使小鼠適應16～24 h。

1.3 主要試劑

藥敏紙片和染色試劑盒購于杭州微生物試劑有限公司,TIANamp Bacteria DNA KIT細菌基因組DNA提取試劑盒、2×Tap PCR MasterMix、2 000 bp DNA Ladder購于天根生化科技(北京)有限公司,麥氏比濁管購于溫州康泰生物科技有限公司,引物購于生工生物工程(上海)技術有限公司,瓊脂糖購于美國海普生物公司,其他試劑均為國產分析純。

2 試驗方法

2.1 細菌的分離鑒定

無菌采集病死豬心臟、腦、肺臟、肝臟等病變組織,劃線接種于營養瓊脂平皿,放入培養箱37℃培養24 h后,觀察細菌生長特性。挑取培養皿平板上不同形狀大小的菌落,分別進行革蘭氏染色鏡檢和純化培養。

2.2 溶血試驗

將擴大培養后的菌液劃線兔血平皿,放入培養箱37℃,培養24 h后,觀察溶血情況、菌落形態、挑取單個菌落進行鏡檢。

2.3 細菌16S rRNA的PCR檢測

參考文獻中的引物序列[7],采用16S rRNA PCR通用引物(上游引物F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3’,下游引物 R：5’-TACGGTTACCTTGTTACGA CTT-3’) 對分離細菌進行PCR擴增,同時使用滅菌ddH20為模板做空白對照。PCR反應體系20 μL：上下游引物各 1.5 μL,ddH2O 5 μL,Mix10 μL,DNA 模板2 μL。PCR反應程序為：預變性94℃5 min；變性94℃45 s；退火溫度56℃45 s；延伸72℃50 s；35個循環；延伸72℃5 min；保溫15℃30 min。反應結束后,PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳,利用凝膠成像系統觀察結果,對疑似目的條帶進行測序。

2.4 細菌血清檢測

針對豬鏈球菌1型、2型、7型和9型莢膜多糖基因CPS所設計的特異性引物[8]Cps1I、Cps2J、Cps7H、Cps9H(引物序列見表1)對分離菌株進行PCR檢測。PCR反應體系20μL：上下游引物各1.5 μL,ddH2O 5 μL,Mix10 μL,DNA模板 2 μL。PCR反應體系為：預變性94℃5 min后進入循環,變性94℃30 s；各種引物的退火溫度見表2；延伸72℃30 s；30個循環后,延伸72℃5 min；保溫15℃30 min[9],反應結束后,利用凝膠成像系統觀察結果。

表1 引物序列

2.5 藥敏試驗

采用紙片擴散法對分離細菌進行藥敏試驗。將純化的細菌在37℃營養肉湯中培養18～24 h,用肉湯將試管中菌液稀釋至0.5(濃度1.5×108CFU/mL)麥氏標準,每個平皿貼5個藥敏紙片,紙片之間距離大于20 mm,紙片中心距平皿邊緣在10～15 mm之間,37℃培養24 h后測抑菌圈直徑,判斷細菌對藥物的敏感性[10],根據試驗結果比較敏感性。

2.6 動物試驗

將擴大培養后的菌液與標準比濁管對比,將其稀釋至1.0(濃度3×108CFU/mL) 麥氏標準。將小白鼠隨機分為對照組和試驗組,每組5只。試驗組,腹腔接種菌液,0.2 mL/只；對照組,腹腔接種培養基,0.2 mL/只；每天觀察記錄小鼠活動狀況2次[11]。

3 結果與分析

3.1 分離純化結果

病料直接涂抹于營養瓊脂平板上,培養24 h后,觀察到直徑0.1～1.0 mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的單個菌落。革蘭氏染色為陽性,菌體單個或者2個卵圓形狀,短鏈狀,鏈較長并長短不一(見圖1-A)。

圖1 革蘭氏染色鏡檢圖

3.2 溶血性結果

兔血瓊脂培養皿上有直徑為0.2～1.0 mm,形成灰白色、半透明、表面光滑、邊緣整齊,存有針尖大小的菌落,具明顯的β溶血環,見圖2。

圖2 血平板上溶血結果

3.3 細菌16S rRNA鑒定

鏈球菌16S rRNA基因PCR擴增產物1.5%瓊脂凝膠電泳圖譜如圖3,在第1泳道出現條帶,擴增出的片段約1 600 bp,第2泳道為空白對照。用BLAST軟件對測序結果進行比對分析,該序列與豬球菌(Genbank登錄號：LC208642.1)同源性為99%,確定該株菌為豬鏈球菌。

圖3 16S rRNA PCR基因擴增產物電泳圖

3.4 血清型鑒定

針對豬鏈球菌1型、2型、7型和9型相對應的Cps1I、Cps2J、Cps7H、Cps9H基因,進行 PCR擴增,產物經1.5%瓊脂凝膠電泳,結果如圖4,在1、3、4泳道未出現條帶,在2泳道上擴增出的片段約250～450 bp,與Cps2J基因擴增預期目的片段相符合,將目的條帶回收后測序。使用BLAST軟件將PCR測序結果在Genbank中進行BLAST比對分析,該序列與豬鏈球菌2型(登錄號：CP020863.1)同源性為99%,結果表明分離菌株為豬鏈球菌2型。

圖4 豬鏈球菌基因擴增產物電泳圖

3.5 藥敏試驗結果

根據NCCLS藥敏判斷標準,對所選藥物的敏感度分析結果見表2。結果顯示,該菌株對氨芐西林、頭孢吡肟、頭孢唑林、慶大霉素、環丙沙星、左氧沙星高度敏感,對卡拉霉素、克林霉素不敏感,對四環素、復方新諾明中度敏感。

表2 藥敏試驗結果

3.6 動物試驗結果

將該菌液接種小白鼠24 h后,小鼠出現轉圈、發抖、精神萎靡等神經癥狀。并且,從接種小白鼠大腦、肝臟、肺臟等組織中分離出鏈球菌(見圖5)。

圖5 小白鼠典型病料染色圖片

4 討論

豬鏈球菌2型主要導致豬的腦膜炎、關節炎、敗血癥及化膿性淋巴結炎等癥狀,此次試驗涉及病豬主要表現轉圈、磨牙、四肢呈劃水狀、盲目走動等神經癥狀,部分關節腫脹、走路成跛行、體溫普遍地升高(41～43℃),剖解后觀察肺部可見明顯出血點,腹股溝淋巴結腫大,切開腦頂部皮膚,皮下有大量淺黃色液體,顱下大面積出血,顱腔內積液,關節腔內有黃色膠凍樣物,且癥狀與豬鏈球菌病基本相符。通過細菌分離純化、16S rRNA基因擴增鑒定從該病豬體內分離到一株豬鏈球菌,對該菌株進行血清型PCR檢測,確定為豬鏈球菌2型。分析其傳播途徑,主要傳染源為豬,經呼吸道、消化道等途徑傳播,也可通過蒼蠅、老鼠攜帶傳播。據報道,該病在一年四季均可發生,西南地區在5—11月發病率最高[12]。近年來,四川畜牧養殖業高速發展,豬鏈球菌疾病帶來的危害也逐漸凸顯,確定豬鏈球菌血清類型對該病的防治非常必要。

藥敏試驗結果表明,鏈球菌屬于革蘭氏陽性菌,理論上本次藥敏試驗所選藥物對其均具有療效,但試驗結果顯示該菌株對β-內酰胺類和喹諾酮類藥物高度敏感,對氨基糖苷類和林可胺類藥物耐藥,對四環素類和磺胺類藥物中度敏感。分析原因：一方面,可能與各個地區用藥習慣不同有關,另一方面,與臨床上不明病因的濫用抗生素有關[13]。

5 小結

豬鏈球菌是引起豬群發病的重要病原之一,也是影響生產效益的因素之一。豬場只有加強飼養管理,提高豬群免疫力,降低豬發病率,有效控制豬群疾病發生,提高養殖人員的積極性,才能提高豬場經濟效益。此外,在西南地區,每年5—11月是豬鏈球菌發病最高時期,著重加強對豬群進行接種免疫、保健、消毒等措施以減少豬群的發病率。對豬鏈球菌病的防控,要注意多觀察、做到“早發現、早隔離、早治療”。