原發性肝細胞癌中核因子κB、核仁蛋白14的表達及與臨床特征的關系

李會平，代愛軍，李亞輝，王帥，邢魯奇

洛陽東方醫院/河南科技大學第三附屬醫院1病理科，2消化內科，河南 洛陽 471003

3河南科技大學第一附屬醫院病理科，河南 洛陽 471003

肝癌是眾多惡性腫瘤中惡性程度較高的腫瘤之一，是由多因素、多階段、多步驟所致，此病具有高發病率、高病死率，嚴重情況下對患者生命安全造成嚴重威脅，其中原發性肝細胞癌是肝癌中最常見的類型，其惡性程度高、侵襲性強[1]。目前臨床暫無治療原發性肝細胞癌的特效藥，多采取手術治療、肝移植、射頻消融治療、經導管動脈化療栓塞術以及放化療等治療手段，但近年來研究發現，由于肝癌起病隱匿、病程發展迅速、易轉移復發等特點，導致多數肝癌患者預后不理想，其中早期沒有特異性的臨床表現以及缺乏早期的診斷手段是肝癌預后差的主要原因[2-3]。因此，發現早期有效生物學指標，在一定程度上有助于改善肝癌患者總體預后。核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）與腫瘤的發生發展和侵襲轉移關系密切；核仁蛋白14（nucleolar protein 14，NOP14）在乳腺癌、胰腺癌等腫瘤中已有相關研究；但關于NF-κB、NOP14在原發性肝細胞癌中的報道鮮少[4-5]。故本研究探討NF-κB、NOP14在原發性肝細胞癌中的表達情況并分析其與患者臨床特征的關系和臨床意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年5月至2021年2月洛陽東方醫院收治的原發性肝細胞癌患者的病歷資料。納入標準：符合《原發性肝癌規范化病理診斷方案專家共識》[6]中原發性肝細胞癌診斷標準；第一次發現并確診為肝細胞癌且在接受根治性肝癌切除治療前未行其他抗腫瘤治療；手術所切除的腫瘤標本均經病理檢查證實為原發性肝細胞癌。排除標準：既往有惡性腫瘤病史；合并其他類型惡性腫瘤；膽管細胞性肝癌、混合型肝癌以及轉移性肝癌。根據納入、排除標準，共納入92例原發性肝細胞癌患者，其中男48例，女44例；年齡28～70歲，平均（46.13±19.39）歲；TNM分期：Ⅰ期48例，Ⅱ～Ⅲ期44例；無門靜脈癌栓49例，有門靜脈癌栓43例；無淋巴結轉移47例，有淋巴結轉移45例；分化程度：中高分化42例，低分化50例。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 檢測方法

使用Western blot法檢測NF-κB、NOP14表達：取腫瘤組織以及距離腫瘤組織5 cm以上的癌旁組織，對組織標本以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）進行沖洗后，行30 min裂解，離心處理10 min，提取上清液，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量，在2×十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）凝膠緩沖液中加入50 μg蛋白，添加完成蛋白緩沖液后開始進行100℃加熱5 min。凝膠電泳、轉膜、取膜，4℃下固定、封閉處理1 h，將一抗使用0.05%～0.10%TBST稀釋，4℃孵育過夜保存，之后使用0.05%～0.10%TBST洗膜3次，每次5 min，二抗被0.05%～0.10%TBST稀釋（1∶10 000），搖動孵育時間為1 h，TBST連續洗膜3次，處理5 min。二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，定量分析蛋白表達情況。以GAPDH為內參，分析NF-κB、NOP14蛋白與內參蛋白灰度值，計算目標蛋白以及內參蛋白灰度值的比值，進而分析NF-κB、NOP14蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件分析數據。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Spearman相關分析；以P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NF- κ B、NOP14相對表達量的比較

腫瘤組織中NF-κB、NOP14相對表達量均明顯高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表1）

表1 癌旁組織、腫瘤組織中NF- κ B、NOP14相對表達量的比較（±s）

表1 癌旁組織、腫瘤組織中NF- κ B、NOP14相對表達量的比較（±s）

組織癌旁組織（n=92）腫瘤組織（n=92）t值P值NF-κB 0.37±0.04 7.59±0.81 85.390<0.01 NOP14 0.43±0.06 9.35±0.97 88.040<0.01

2.2 不同臨床特征原發性肝細胞癌患者腫瘤組織中NF- κ B、NOP14表達水平的比較

Ⅱ～Ⅲ期、有門靜脈癌栓、有淋巴結轉移、低分化原發性肝細胞癌患者的腫瘤組織中NF-κB、NOP14相對表達量均明顯高于Ⅰ期、無門靜脈癌栓、無淋巴結轉移、中高分化原發性肝細胞癌患者，差異均有統計學意義（P﹤0.01）。（表2）

表2 不同臨床特征原發性肝細胞癌患者腫瘤組織中NF- κ B、NOP14表達水平的比較

2.3 NF- κ B、NOP14與臨床特征的相關性分析

NF-κB、NOP14表達與原發性肝細胞癌患者TNM分期、門靜脈癌栓、淋巴結轉移及分化程度均呈正相關（P﹤0.01）。（表3）

表3 NF- κ B、NOP14與原發性肝細胞癌患者臨床特征的相關性

3 討論

據多項研究數據顯示，肝癌在消化系統惡性腫瘤中病死率居第三位且是屬于全球五大惡性腫瘤之一，其中原發性肝細胞癌是肝癌的常見類型，此病患者在早期時無典型臨床癥狀，不易引起患者重視，但隨著臨床癥狀的顯現，確診時患者多處于中晚期且部分患者在初診時已出現肝外轉移[7-9]。隨著科學發展和醫療技術水平的提升，肝癌在術前確診的準確性、影像學與血清腫瘤標志物檢查的便利性和準確性隨之升高[10]。但至今肝癌患者的預后情況仍然較差，一方面與肝癌的惡性程度較高、易轉移的特點有關，另一方面與缺乏有效的早期診斷手段有關[11-12]。故研究并發現有效的早期生物學標志物對肝癌的診治具有重要意義。

NF-κB是一種核蛋白因子且具有多向轉錄調節作用，在細胞生理病理過程，如炎癥、細胞增殖以及氧化應激中發揮著重要作用，若其被激活對凋亡基因的轉錄以及細胞凋亡起調節作用，可通過活化細胞核內DNA鏈、破壞效應性caspase 3蛋白、引起細胞結構解體等加劇細胞死亡的發生發展[13-15]。有研究顯示，NF-κB信號通路的異常激活在眾多類型腫瘤中均有所發現，這可能與腫瘤的發生發展以及轉移密切相關，NF-κB在此信號通路中作為重要的通路調節因子之一，若受到外界刺激其核定位位點會因NF-κB磷酸化被暴露，隨之NF-κB轉移至細胞核，進而通過調控相關基因轉錄及表達，對細胞的生物學行為產生影響，有望成為疾病靶向治療的新靶點[16-17]。高超等[18]研究報道，NF-κB在膀胱癌中與患者病理分級、臨床分期存在密切關聯，其中NF-κB高表達可能與腫瘤的惡性程度及侵襲能力有關，可作為膀胱癌的潛在分子標志物。在本研究中，NF-κB在腫瘤組織中的表達水平高于癌旁組織，且與原發性肝細胞癌患者TNM分期、門靜脈癌栓、淋巴結轉移、分化程度密切相關，有望成為診斷原發性肝細胞癌的分子標志物，但在本研究中并未探討NF-κB在原發性肝細胞癌中的具體作用機制，有待后續深入研究。

NOP14基因位于染色體4p16.317，多項臨床研究報道，NOP14在黑色素瘤中呈異常高表達，對腫瘤細胞的發生發展具有促進作用[19-20]。杜永星等[21]在動物實驗中發現，NOP14在胰腺癌肝轉移灶中表達水平顯著升高，其作用機制可能為NOP14促進腫瘤微血管形成和胰腺癌的生長和轉移，加劇腫瘤惡性程度。研究顯示，NOP14是多梳抑制復合物的靶基因，其高表達在肝癌的發生發展中發揮了重大作用，可促進肝癌的增殖、侵襲轉移能力，進一步增強腫瘤的惡化程度，且與肝癌的早期篩查、診斷及預后密切相關[22]，說明NOP14具有作為肝細胞癌分子靶向治療新靶點的潛力。在本研究中，NOP14在原發性肝細胞癌患者腫瘤組織中呈異常高表達且與患者臨床特征密切相關，提示NOP14參與了原發性肝細胞癌的發生發展過程。

綜上所述，原發性肝細胞癌患者腫瘤組織中NF-κB、NOP14呈異常高表達。同時相關性分析發現，NF-κB、NOP14表達與原發性肝細胞癌患者臨床特征存在密切關聯，測定NF-κB、NOP14表達對評估原發性肝細胞癌患者病情具有重要意義。但本研究樣本量較小、患者來源受地域限制，且未對NF-κB、NOP14與原發性肝細胞癌患者預后的關系進行分析，缺乏深入研究，需進一步增加樣本量進行多中心研究證實。