HPLC法測定肝素鈉注射液中6種抑菌劑

由鵬飛，李春煥，陳曉，張迅杰，薛維麗，張乃斌

(山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局仿制藥研究與評價重點實驗室，山東省仿制藥一致性評價工程技術研究中心，山東 濟南 250101)

肝素鈉注射液為肝素鈉的滅菌水溶液，主要用于心腦血管疾病和血液透析治療。《中國藥典》2020年版中規定多劑量包裝的注射液可加適宜的抑菌劑，靜脈給藥與腦池內、硬膜外、椎管內用的注射液均不得加抑菌劑[1]，肝素鈉注射液屬于單劑量包裝的注射劑，且各生產企業說明書中用法用量均包括靜脈注射及靜脈滴注，目前仍有部分企業添加苯酚作為抑菌劑。注射液中常用的抑菌劑有：醇類(苯甲醇、三氯叔丁醇)、酚類(苯酚)、酯類(羥苯酯類)等[2-5]，不同抑菌劑的機理不同，但普遍存在一定的毒副作用[6-8]，如苯酚有致癌風險，苯甲醇的降解和代謝產物苯甲醛具有中樞神經系統毒性，三氯叔丁醇可導致溶血反應，羥苯酯類可導致過敏反應等，因此，有必要對肝素鈉注射液進行抑菌劑檢查。目前已有高效液相色譜(HPLC)法測定肝素鈉注射液中苯酚的報道[9]，但其中未對其他抑菌劑進行檢測，因此本文建立了HPLC法同時測定肝素鈉注射液中苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯及羥苯丙酯等6種抑菌劑的含量，為更好地質控肝素鈉注射液的質量提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20A液相色譜儀(日本島津公司)，PDA檢測器；Mettler Toledo XSE205DU電子天平(德國梅特勒公司)。

1.2 試劑試藥 甲醇為色譜純；水為Millipore Q-POD制備的純化水；其他試劑均為分析純。

肝素鈉注射液：來自2021年國家評價性抽驗，包括11家生產企業共100批樣品。

對照品：苯酚(中檢院，批號：100509-201804，含量：100.0%)；苯甲醇(中檢院，批號：190019-202004，含量：99.7%)；三氯叔丁醇(Cato Research Chemicals，批號：0622-RB-0005，含量：99.8%)；羥苯甲酯(中檢院，批號：100278-201906，含量：99.9%)；羥苯乙酯(中檢院，批號：100847-202105，含量：100.0%)；羥苯丙酯(中檢院，批號：100444-202005，含量：99.9%)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為水，流動相B為甲醇，洗脫程序見表1，流速：1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，進樣量20 μL。檢測波長：苯酚、苯甲醇、三氯叔丁醇選擇220 nm；羥苯甲酯、羥苯乙酯、羥苯丙酯選擇256 nm。

表1 HPLC 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液 分別精密稱取苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇及羥苯丙酯標準品約25 mg置10 mg量瓶中，用甲醇-水(1∶1)溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成6種對照品貯備溶液，分別精密量取上述貯備溶液適量，用甲醇-水(1∶1)溶液稀釋成濃度分別為400.06、1671.88、490.4、85.81、793.54、80.45 μg·mL-1的對照品溶液1。

2.2.2 供試品溶液 分別精密量取肝素鈉注射液1 mL置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。

2.3 系統適用性 精密量取20 μL“2.2.1”項下對照品溶液1進樣，記錄色譜圖，出峰順序依次為苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇及羥苯丙酯(見圖1)。各相鄰峰之間的分離度均不小于1.5。

圖1 系統適用性試驗色譜圖

2.4 線性關系試驗 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液1，逐級稀釋成含苯酚濃度為200.03、100.02、50.01、25.00 μg·mL-1；含苯甲醇濃度為835.94、417.97、208.99、104.49 μg·mL-1；含羥苯甲酯濃度為245.20、122.60、61.30、30.65 μg·mL-1；含羥苯乙酯濃度為42.91、21.45、10.73、5.36 μg·mL-1；含三氯叔丁醇濃度為396.77、198.39、99.19、49.60 μg·mL-1；含羥苯丙酯濃度為40.23、20.11、10.06、5.03 μg·mL-1的對照品溶液2～5，分別精密吸取系列對照品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，結果見表2。

表2 線性關系考察結果

2.5 系統精密度試驗 精密量取20 μL對照品溶液3，連續進樣6 次，記錄色譜圖，測其峰面積，計算RSD。苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇及羥苯丙酯峰面積的RSD分別為0.10%、0.20%、0.03%、0.06%、0.49%、0.13%，表明系統精密度良好。

2.6 穩定性試驗 取“2.4”項下制備的對照品溶液3，精密吸取20 μL，注入液相色譜儀，每隔5 h進樣一次，測定6種抑菌劑的峰面積，共考察25 h，計算峰面積的RSD，以觀察在檢測過程中待測成分的穩定性。苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇及羥苯丙酯峰面積的RSD分別為0.12%、0.73%、0.02%、0.24%、0.58%、0.12%，試驗結果表明，對照品溶液在25 h內穩定性良好，能夠滿足測定需要。

2.7 定量限測定 取對照品溶液進行稀釋后進樣，以信噪比S/N=10 計，苯酚的定量限為0.1 μg·mL-1、苯甲醇的定量限為1 μg·mL-1、三氯叔丁醇的定量限為20 μg·mL-1、羥苯甲酯的定量限為0.03 μg·mL-1、羥苯乙酯的定量限為0.1 μg·mL-1、羥苯丙酯的定量限為0.3 μg·mL-1。

2.8 加樣回收率試驗 精密量取肝素鈉注射劑(處方中苯酚的含量為2.5 mg·mL-1)4 mL置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度。再分別精密量取2、2.5、3 mL對照品溶液1置20 mL量瓶中，分別精密加入供試品溶液10 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，制成低、中、高濃度的溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，計算苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇和羥苯丙酯的回收率，結果見表3。結果表明，6種抑菌劑回收率在90%～110%，RSD均不超過2.0%。

表3 加樣回收率試驗結果

2.9 樣品測定 取收集到的11家企業100個生產批次的肝素鈉注射液樣品，以“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算抑菌劑含量。檢出3家生產企業使用苯酚作為抑菌劑，其他抑菌劑未檢出。本次檢驗的結果表明，11家生產企業中有3家工藝處方中添加苯酚，測定結果與理論加入量相符，未檢出其他5種抑菌劑；其他8家企業工藝處方中未添加抑菌劑，6種抑菌劑均未檢出。

3 討論

雖然抑菌劑在規定的使用濃度范圍內一般是安全的，但由于其本身存在毒性，仍會導致一些不良反應發生，因此應加強對注射劑中抑菌劑的監管和檢測，特別對于單劑量包裝的注射劑，應盡量避免抑菌劑的使用。我們根據各肝素鈉注射液生產企業中苯酚的理論加入量以及文獻報道[10-11]，確定了6種抑菌劑的對照品溶液的濃度，方法學驗證結果表明，本文建立的HPLC法適用于肝素鈉注射液中苯酚、苯甲醇、羥苯甲酯、羥苯乙酯、三氯叔丁醇和羥苯丙酯等6種抑菌劑的含量測定，可作為肝素鈉注射液質量安全評價方法，為更好地控制肝素鈉注射液的質量提供依據。