基于網絡藥理學及分子對接技術分析丹參-川芎-葛根抗高血壓的分子機制

李新，劉肖瑩，蔣蕾，楊波*，彭海生*

(1.哈爾濱商業大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.哈爾濱醫科大學大慶校區藥學院，黑龍江 大慶 163319)

高血壓是引起冠心病和腦卒中等心腦血管疾病的危險因素[1]。人口老齡化的加劇以及青年群體不健康的生活飲食習慣，增加了高血壓的發病概率[2]，因此防治高血壓已成為我國公共衛生安全的一項嚴峻挑戰[3]。前臨床使用的化藥降壓藥有ACEI類、β受體阻滯劑、利尿劑、鈣離子拮抗劑四大類。而在我國中醫古籍對高血壓無直接論述，而是以“眩暈”“頭痛”等進行治療[4]，丹參-川芎-葛根是常與西藥降壓藥聯用的藥物，由丹參、川芎、葛根三味藥組成。趙健[5]研究表明，丹參-川芎-葛根和苯磺酸氨氯地平聯用，可安全有效的治療高血壓；而丹參、川芎、葛根也常用于治療高血壓的方劑中，但是丹參-川芎-葛根降血壓的機制尚不明確。

網絡藥理學最初由Hopkins[6]于2007年率先提出，從系統生物學角度研究并闡釋中藥作用成分及作用機制，這與傳統中藥通過多成分、多靶點對機體進行整體作用的觀點相一致[7]。本研究利用網絡藥理學的方法分析丹參-川芎-葛根治療高血壓的分子機制，為進一步研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 篩選丹參、川芎、葛根活性成分及作用靶點 以丹參、川芎、葛根為詞條，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18作為條件[8]，在中藥系統藥理學分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP)(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.Php)篩選活性成分和作用靶點。在UniProt數據庫(https://www.uniprot.org)，進行靶點標準化。以“Hypertension”為詞條，檢索Genecards(https://www.genecards.org)數據庫，得到高血壓相關靶點。

1.2 “藥材-活性成分-靶點蛋白”網絡的構建 利用Cytoscape 3.6.0版軟件，將篩選出的活性成分和靶點構建“藥材-活性成分-靶點蛋白”網絡圖。

1.3 有效成分與疾病靶點的韋恩圖及靶點蛋白相互作用(PPI)網絡的構建 運用韋恩圖數據庫(Venn Diagram，Venny)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)合并活性成分靶點和高血壓相關靶點，獲得交集靶點。STRING在線分析平臺(https://string-db.org/)，選擇置信度>0.7的交集靶點[9]，預測靶點與靶點之間的相互作用關系，構建抗高血壓靶點PPI網絡圖。

1.4 通路富集分析 用RStudio-1.4.1106進行基因的本體(gene ontology，GO)生物學過程富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，并對分析結果進行可視化分析，建立靶點蛋白和通路的聯系，并構建“活性成分-靶點-通路”網絡。

1.5 分子對接 將PPI網絡圖中得到的核心靶點與活性成分進行分子對接。在TCMSP數據庫中下載活性成分的mol2格式。從PDB數據庫(https：//www.rcsb.org/)獲得靶蛋白的pdb格式[10]。通過AutoDock Tools 1.5.6版軟件處理靶蛋白，去除水分子，添加全氫，分離配體和受體，保存為pdbqt格式。將活性成分導入AutoDock Tools 1.5.6軟件，添加全氫，分配原子類型，所有柔性鍵均默認可旋轉，保存為pdbqt格式。將處理后的靶蛋白和活性成分進行對接，并運用Pymol進行可視化處理。

2 結果

2.1 丹參-川芎-葛根活性成分及作用靶點篩選結果 通過TCMSP數據庫的篩選共獲得68個已知有效活性成分，其中丹參59個，川芎6個，葛根3個。通過Genecards數據庫以相關性>10為篩選條件[11]，得到759個與高血壓相關的靶點。活性成分見表1。

表1 丹參-川芎-葛根篩選后得到的68個活性成分

表1(續)

2.2 “藥材-活性成分-靶點”網絡圖構建結果 通過Cytoscape 3.6.0軟件構建藥材-活性成分-靶點網絡圖(見圖1)。其中共包含217個節點(68個活性成分和146個靶點)，1 045條線。紅色菱形代表靶點；藍色六邊形代表黨參活性成分；綠色六邊形代表川芎活性成分；黃色六邊形代表葛根活性成分。度值(degree)和節點(betweenness)與活性成分呈正相關狀態，節點越大，越重要[12]。

圖1 藥材-成分-靶點圖

2.3 有效成分靶點與疾病靶點韋恩圖及PPI網絡的建立與分析 在Venny數據庫共獲得62個疾病和藥材的交集靶點(見圖2)。將得到的交集靶點，導入STRING在線分析平臺得到抗高血壓靶點PPI網絡關系，并導入Cytoscape 3.6.0進行進一步的拓撲分析(見圖3)。最終獲得人內皮型一氧化氮合酶(NOS3)、蛋白激酶Bα2(AKT1)、白細胞介素-6(IL-6)、低聚果糖(FOS)、血管內皮生長因子(AVEGFA)和內皮素1(EDN1)等關鍵靶點。

圖2 韋恩圖

圖3 抗高血壓靶點PPI網絡圖

2.4 通路富集分析 運用RStudio 1.2.5019軟件得到1 871個GO富集條目(P<0.05)，其中生物過程(biological process，BP)條目1 767個，細胞組成(cellular component，CC)條目21個，分子功能(molecular function，MF)相關的條目74個。取前10的BP、CC、MF過程建立富集通路(見圖4)。KEGG通路富集，篩選出129條信號通路(P<0.05)，取基因占比前20的疾病相關通路利用RStudio 1.2.5019軟件制作可視化氣泡圖，結果見圖5。

篩選出11條與高血壓可能相關的通路，構建“成分-靶點-通路”多維網絡(見圖6)。其節點大小和顏色深度與它們在網絡中的度值有關。圓形代表通路；菱形代表成分；箭頭代表靶點。由圖可知，流體剪切應力和動脈粥樣硬化、鈣信號通路、AGE-RAGE、松弛素、cGMP-PKG等11個信號通路，共涉及58個活性成分，46個靶點。

其中準確度最高(P最小)的是流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路(fluid shear stress and atherosclerosis)，其富集通路見圖7。由圖可知丹參-川芎-葛根主要通過作用于VEGFR、NOS3、AKT1等靶蛋白調控流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路，起到抗高血壓及其并發癥的作用。

圖6 丹參-川芎-葛根活性成分-靶點-通路圖

圖7 流體剪切應力和動脈粥樣硬化通路

2.5 分子對接 將“藥材-活性成分-靶點”網絡中“degree”>20的活性成分，與關鍵靶點NOS3、AKT1、IL-6、FOS、VEGFA和EDN1進行結合能預測，結果見表2。用PyMOL軟件將對接結果可視化，結果見圖8。Hsin等[13]證明結合能<-4.25 kcal·mol-1提示配體與受體有一定的結合活性，<-5.0 kcal·mol-1有較好的結合活性，<-7.0 kcal·mol-1有強烈的結合活性。

a.隱丹參酮-NOS3；b.β-谷甾醇-FOS；c.丹參酮ⅡA-EDN1；d.丹參酮ⅡA-EDN1；e.丹參酮ⅡA-VEGFA；f.β-谷甾醇-AKT1圖8 分子對接模式圖

表2 活性成分及靶蛋白結合能預測

3 討論

借助網絡藥理學的方法，整理得到了抗高血壓作用的68個化學成分，62個潛在靶點。丹參-川芎-葛根相互作用網絡，體現出一個成分與多個靶點相關聯，一個靶點與多種成分相關聯的機制。通過對丹參的分析，其主要降壓成分是酮類化合物，丹參酮ⅡA通過降低NO水平，抑制內皮素-1(ET-1)生成，起到降血壓的目的[14]。川芎中降血壓的主要活性成分為楊梅酮，楊梅酮可以顯著提高磷酸化AKT的水平，降低p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 MAPK)的磷酸化和核因子κB/p65的水平[15]。葛根中降血壓的主要活性成分有β-谷甾醇和芒柄花黃素，β-谷甾醇可降低血脂[16]；芒柄花黃素主要是通過下調p47phox和NOX4的mRNA含量間接性對降血壓起到作用[17]。

從PPI網絡圖得到核心靶點NOS3、FOS、EDN1、VEGFA、IL-6、AKT1。辛穎等[18]研究發現，NOS3基因多態性與高血壓繼發左心室肥厚相關聯；Wu等[19]證明FOS基因與腎髓質性高血壓有關；Jiao等[20]研究表明，EDN1基因與肺動脈高壓有關；謝志偉[21]的研究表明，VEGFA基因與高血壓密切相關；吳阿敏[22]研究表明IL-6蛋白與低氧肺動脈高壓有關；齊書涵等[23]研究表明，血管重構與高血壓循環作用，而AKT1對血管重構有重要作用。

GO富集分析結果顯示，丹參-川芎-葛根的核心靶點是通過影響血管內皮功能、藥物反應及氧化應激等生物過程對高血壓病進行調控。KEGG通路富集分析結果顯示，丹參-川芎-葛根通過調節流體剪切應力和動脈粥樣硬化、鈣信號通路、AGE-RAGE、松弛素、cGMP-PKG信號通路來治療高血壓。較高的血流剪切力對維持血管內皮功能有利，減少內皮損傷因子分泌，保護血管內膜，起到預防高血壓的作用[24]。鈣信號傳導機制對心臟和血管等相關疾病發揮重要作用[25]。海長娥等[26]研究證明高血壓與AGE-RAGEA密切相關。高血壓患者的血漿松弛素水平明顯下降[27]。cGMP促使NO松弛血管平滑肌[28-29]。施偉麗等[30]證實激活cGMP-PKG信號通路對自發性高血壓有療效。

綜上所述，利用網絡藥理學和分子對接技術，對丹參-川芎-葛根治療高血壓的作用機制做了初步探討。結果顯示，木犀草素和丹參酮ⅡA等成分主要通過流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路，作用于NOS3、AKT1、IL-6、FOS、VEGFA和EDN1等靶點發揮作用。為進一步研究高血壓藥物提供參考。