萼花臂尾輪蟲對晶囊輪蟲反捕食行為及形態響應的母體效應

何雨晗 張 歡 ?？缀? 趙康順, 李海露 徐 軍

(1.中國科學院水生生物研究所淡水生態與生物技術國家重點實驗室,武漢 430072;2.中國科學院大學,北京 100049;3.南昌大學資源環境與化工學院,鄱陽湖環境與資源利用教育部重點實驗室,南昌 330000)

捕食與被捕食關系是組成食物網結構的基礎[1,2]。捕食壓力能誘導生物產生特異性反捕食響應,如行為、形態、生理生化和生活史響應等。這些響應可降低生物被捕食的風險,或者增加生物與捕食者接觸后的逃脫率[3—7]。因此,研究反捕食響應有助于深入理解食物網中不同生物間的互動機制,為預測食物網動態提供支持。

輪蟲體型微小,分布廣泛,具有較高的生物量及年周轉量[8,9],是許多水生動物的重要食物源。輪蟲連接初級生產者和較高營養級,其與捕食者的互動關系具有重要的研究意義。目前已知至少19種輪蟲可產生特異性反捕食響應[10—13],包括形態響應(產生棘刺、增加或縮小體型等)、生活史響應(產生更多或更少的幼體、改變后代性別比例等),以及行為響應(產生附著、躲避或漂浮行為)[14—18]。但現有研究多數是關于特異性的形態變化及伴隨產生的生活史特征變化[19,20],對于反捕食行為響應研究較少。直到最近才有研究顯示輪蟲除形態響應之外,還可產生行為響應[18]。例如,捕食者晶囊輪蟲 (Asplanchna) 可使變異臂尾輪蟲(Brachionus variabilis) 增大體型,并增加附著在物體表面的比例[21];紅臂尾輪蟲 (B.rubens) 雖然沒有反捕食形態響應,但晶囊輪蟲可使其增加表面附著比例[13]。西氏晶囊輪蟲 (A.sieboldi) 可使萼花臂尾輪蟲 (B.calyciflorus) 迅速漂浮至水體表面并保持一定時間[18]。

除直接接觸捕食者,產生響應之外,輪蟲還能通過母體效應產生形態及生活史響應[22,23]。例如,經捕食者刺激并移除刺激物質可使臂尾輪屬輪蟲產生具有反捕食形態的后代[16,22]。在面臨捕食者時,這種通過母體效應產生的防御形態可讓體型較小的輪蟲在接觸捕食者后成功逃脫。但除形態響應之外,輪蟲反捕食行為響應能否通過母體效應產生仍然未知。

萼花臂尾輪蟲分布廣泛,關于其對生物或非生物環境因素的響應已有許多報道[24—26]。在這些研究基礎上,本文以萼花臂尾輪蟲 (B.calyciflorus) 為被捕食者,以卜氏晶囊輪蟲 (A.brightwellii) 為捕食者,設計實驗研究萼花臂尾輪蟲能否通過母體效應產生行為響應。目前已知捕食者誘導液可能通過三種途徑誘導輪蟲產生反捕食響應(直接作用于輪蟲卵細胞表面受體;滲透卵細胞,對幼體產生作用;影響母體,使其產生具有反捕食響應的后代)[10]。此外,輪蟲在捕食者誘導液中暴露的時間長短也會影響輪蟲形態及生活史特征[19]?？紤]到不同的誘導途徑及作用時間可能產生的影響,我們通過實驗設計,將處于不同帶卵狀態的萼花臂尾輪蟲放入捕食者誘導液中暴露不同時間后,將輪蟲從誘導液中取出,放入正常培養液培養。待這批輪蟲產生后代,收集后代并將后代再次暴露在捕食者誘導液中,對比這批后代與未經捕食者誘導的母體產生的后代的漂浮行為差異及形態差異,并分析行為和形態響應與不同誘導途徑及作用時間的關系,為種間關系與母體效應的聯系研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

萼花臂尾輪蟲由采集自武漢下涉湖(北緯:30°8′35″,東經:114°10′20″)的休眠卵孵化而得。在輪蟲孵化后,隨機挑選一個非混交個體于EPA培養液中進行單克隆繁殖[27],獲得萼花臂尾輪蟲種群。捕食者卜氏晶囊輪蟲采集自保安湖(北緯:30°14′39″,東經:114°43′37″),隨機挑選一個非混交個體用EPA培養液中進行單克隆繁殖,獲得卜氏晶囊輪蟲種群。

在日常培養及正式實驗中,在BG-11培養液中培養小球藻(Chlorellasp.,FACHB-1067,中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫)并用其投喂萼花臂尾輪蟲[28],喂養密度約為1×106個/mL。再用培養的萼花臂尾輪蟲投喂卜氏晶囊輪蟲,喂養密度約為10 只/mL。所有輪蟲及小球藻均在恒溫光照培養箱中培養,光照周期(光∶暗)為14h∶10h,光照強度為1500 lx,培養溫度為(24±1)℃。在正式實驗之前,所有的輪蟲均在適宜生長條件下的光照培養箱內培養至少1個月,并保證實驗時輪蟲種群處于指數增長期。

所有實驗均采用卜氏晶囊輪蟲誘導液模擬捕食者存在的情況,以免捕食者攝食影響觀測結果。在實驗正式開始前12h,在500 mL EPA培養液中放入40只大小相當的晶囊輪蟲個體(濃度:80只/L),并投喂隨機挑選的萼花臂尾輪蟲(1000 只/L),12h后過0.2 μm濾網,收集得到捕食者誘導液。正式實驗時,用EPA培養液將誘導液濃度稀釋至40只/L使用。在所有實驗中,小球藻添加密度均為1×106個/mL。所有實驗均在(24±1)℃的室內進行。

1.2 實驗一:萼花臂尾輪蟲短期暴露于捕食者誘導液后,后代個體再次暴露于捕食者誘導液中的行為響應

本實驗研究萼花臂尾輪蟲母體在捕食者誘導液中暴露2h后,后代個體再次暴露于捕食者誘導液時,與沒有母體暴露經歷的個體的后代相比,能否產生更強烈的漂浮行為。實驗分2組,分別為對照組(母體未暴露于晶囊輪蟲誘導液中)、暴露組(母體在晶囊輪蟲誘導液中暴露2h)。隨機挑選約1000只未帶卵萼花臂尾輪蟲,并等分為兩批,分別放入EPA培養液和捕食者誘導液中培養2h。然后用吸管挑出經捕食者誘導液處理的萼花臂尾輪蟲,并用EPA培養液潤洗3遍,然后放入EPA培養液中。隨后,每隔2h觀察母體的繁殖情況,待有大量新生幼體孵化后,分別收集對照組和暴露組中產生的幼體。每一組設置8個平行樣品,每1平行樣品含30只幼體,將對照組和暴露組的幼體分別放入50 mL晶囊輪蟲誘導液中并混勻。待所有輪蟲放入后10min、30min、1h、2h、4h及6h用顯微鏡 (SOPTOP SZ) 于6.7倍下觀察并統計漂浮于水面的輪蟲個體。在觀察結束后,立即用魯哥試劑固定所有輪蟲,統計每一平行樣中輪蟲數量,隨后計算實驗過程中不同觀察時間段內輪蟲的漂浮率。

1.3 實驗二:萼花臂尾輪蟲較長時間暴露于捕食者誘導液后,后代個體的行為響應

本實驗研究萼花臂尾輪蟲在晶囊輪蟲誘導液中暴露18h后,后代個體再次暴露于捕食者誘導液時,與沒有母體暴露經歷的個體相比,能否產生更強烈的漂浮行為。本實驗共設置3組,分別為對照組(母體未暴露于晶囊輪蟲誘導液中)、18h不帶卵暴露組(輪蟲母體在晶囊輪蟲誘導液中暴露18h后,挑選出仍處于未帶卵狀態的萼花臂尾輪蟲并放回EPA培養液中)及18h帶卵暴露組(將輪蟲母體在晶囊輪蟲誘導液中暴露18h后,挑選已帶卵的個體,并放回EPA培養液中)。由于每1組所需輪蟲較多,同時觀察較多數量可能產生混淆,因此本實驗將經18h誘導處理后帶卵與不帶卵樣品分兩次進行實驗,記為子實驗1和子實驗2,以減小挑選時間可能帶來的影響。

與1.2的實驗設計類似,子實驗1中,隨機挑選約1000只未帶卵萼花臂尾輪蟲,均分為兩批,分別放入EPA培養液和晶囊輪蟲誘導液中培養18h。期間,每隔2h觀察萼花臂尾輪蟲帶卵情況。18h后,用吸管挑出誘導液中已經帶卵的輪蟲,用EPA培養液潤洗3遍,除去可能殘余的誘導液后,放入EPA培養液中培養。隨后步驟與1.2相同。子實驗2與子實驗1類似,但在將母體暴露18h后,挑選未帶卵萼花臂尾輪蟲,用EPA培養液潤洗3遍后,放入EPA培養液中培養。隨后步驟同1.2所述。

1.4 實驗三:母體于捕食者誘導液中暴露時間及帶卵狀態對萼花臂尾輪蟲后代形態特征影響

實驗前,挑選約1000只未帶卵萼花臂尾輪蟲,并將輪蟲分為四組:分別為對照組(C,用EPA培養液處理萼花臂尾輪蟲母體)、短期暴露組(T1,萼花臂尾輪蟲母體于捕食者信息素中暴露2h)、長期暴露不帶卵組(T2,萼花臂尾輪蟲母體于捕食者信息素中暴露18h后,收集仍未帶卵的個體)和長期暴露帶卵組(T3,萼花臂尾輪蟲母體于捕食者信息素中暴露18h后,收集已帶卵的個體),其中T1與實驗一過程相同,T2和T3與實驗二過程相同。暴露2h或18h后,將晶囊輪蟲誘導液中的萼花臂尾輪蟲用EPA培養液潤洗三遍,放入EPA培養液中,每2h觀察產幼體情況。待有大量新生幼體孵化后,在不同組中隨機挑選新生幼體各30只,用魯哥試劑固定并測量被甲長 (Lorica length)、被甲寬 (Lorica width)和后側棘刺長 (Posterolateral spine length)。通過上述指標計算得出輪蟲體積(體積=0.2A2B,其中A=被甲長,B=被甲寬)、后側棘刺長度及后側棘刺與被甲長之比[29]。所有形態測量均在顯微鏡 (Olympus X41) 及顯微鏡拍攝系統 (Mshot) 上完成。

1.5 統計分析

在實驗一與二中存在重復觀測數據,因此我們用廣義線性混合模型分析萼花臂尾輪蟲漂浮數據。由于數據不滿足正態性,將輪蟲漂浮率進行對數轉換后 (lg[(y+ε)/(1–y+ε)],其中ε為除漂浮率為零之外的最小輪蟲漂浮率)[30],用glmmTMB包中glmmTMB函數的高斯分布分析捕食者誘導液對萼花臂尾輪蟲漂浮率的影響(實驗一,固定變量:不同誘導液處理;實驗二,固定變量:不同誘導液處理,母體帶卵狀態。兩組實驗隨機變量:不同平行及觀測時間),并用lsmeans包中的Tukey’s HSD對不同處理進行兩兩比較。實驗三采用方差分析 (ANOVA)統計母體暴露時間長短與幼體體積的關系,并用廣義線性模型 (GLM) 分析不同母體暴露時間及狀態處理后側棘刺長度的差異是否具有顯著性。用非參數檢驗 (Kruskal-Wallis test) 統計不同處理輪蟲幼體產生棘刺的比例。所有分析均在R 4.0.4中完成[31]。

2 結果

2.1 母體短期暴露于捕食者誘導液中對萼花臂尾輪蟲后代再次暴露于捕食者時的行為影響

萼花臂尾輪蟲母體在晶囊輪蟲誘導液中暴露2h后,其后代個體再次暴露于捕食者誘導液中時,漂浮率與沒有母體暴露經歷的個體相比,沒有顯著差異(圖 1,GLMM,z=–0.280,P=0.779)。

圖1 萼花臂尾輪蟲母體于捕食者誘導液中暴露2h后后代的漂浮率Fig.1 The effect of 2h pre-exposure in Brachionus calyciflorus parental generation on the floating ratio of offspring

2.2 萼花臂尾輪蟲母體長期暴露在捕食者誘導液中對后代再次暴露于捕食者誘導液中的行為影響

當萼花臂尾輪蟲在卜氏晶囊輪蟲誘導液中暴露18h后,無論在暴露過程中是否形成卵,其產生的后代與對照組(沒有母體暴露經歷的后代)相比,當放入捕食者誘導液中時,均表現出更強烈的漂浮行為響應 (表 1與圖 2)。但暴露相同時間后 (18h),母體是否帶卵不影響后代的漂浮率(Tukey’sHSD,t=0.011,P=0.999)。

圖2 萼花臂尾輪蟲母體于捕食者誘導液中暴露18h后,后代個體再次暴露于捕食者誘導液時的漂浮率Fig.2 The effect of 18h pre-exposure in Brachionus calyciflorus parental generation on the floating ratio in their offspring generation

表1 實驗二GLMM統計結果Tab.1 GLMM result for experiment 2

2.3 萼花臂尾輪蟲母體在捕食者誘導液中暴露不同時間后,后代的形態特征

萼花臂尾輪蟲母體在晶囊輪蟲誘導液中暴露不同時間后,產生的后代體積具有差異(圖 3)。母體暴露時間越長,產生的后代平均體積越大(圖 3A)。暴露相同時間時 (18h),母體是否帶卵對后代體型無顯著影響(圖 3B)。但母體暴露時間及帶卵狀態可顯著影響后代的后側棘刺長度(圖 3B與表 2)。其中,母體長時間暴露于捕食者誘導液中且在誘導液中形成卵后,產生的幼體后側棘刺最長,且這一組后代具有最大的后側棘刺與被甲長度比(圖 3D)。此外,無論暴露時間長短,捕食者誘導后的母體產生的幼體均具有后側棘刺(圖 3C,Kruskal-Wallis test,P＜0.001)。

表2 母體暴露不同時間后,后代個體后側棘刺長度多重比較差異Tab.2 Multiple comparison result of different maternal exposure time on the posteralateral spine length of offspring

圖3 萼花臂尾輪蟲母體于捕食者誘導液中暴露2h(T1)、18h帶卵(T2)、18h不帶卵(T3)及未暴露(C)后,后代個體的形態特征Fig.3 The effect of pre-exposure in Brachionus calyciflorus parental generation for 2h (T1),18h oocyte (T2),18h non-oocyte(T3) and control (C) treatment on the morphological response in their offspring generation

3 討論

許多生物可通過母體效應產生反捕食防御[32—34]。例如,經捕食者幽蚊 (Chaoborus flavicans) 誘導處理的僧帽溞 (Daphnia cucullata) 產生的后代具有更大的頭盔 (Helmet)[35]。經晶囊輪蟲誘導的臂尾輪蟲產生的后代具有較長的棘刺[22,23]。此外,與沒有經捕食者誘導處理的個體相比,誘導處理的母體產生的休眠卵孵化后產生的防御性棘刺較短[36]。這些結果表明生物可通過母體效應產生反捕食形態響應。近年來也有研究發現生物可通過母體效應產生行為響應[37,38]。例如,經捕食者誘導處理的蟋蟀母體產生的后代具有更強的反捕食移動能力[38]。我們的研究同樣為這一觀點提供了有力論據,即經捕食者誘導處理后,輪蟲不僅直接產生行為響應,也能通過母體效應產生形態防御,還可通過母體效應產生行為響應。

當萼花臂尾母體短時間 (2h) 暴露于晶囊輪蟲捕食者誘導液后,后代再次暴露在誘導液中的行為與沒有母體暴露處理的后代相比,沒有顯著差異。而母體曾較長時間 (18h) 暴露于誘導液后產生的后代則具有顯著的反捕食漂浮行為。該結果顯示通過母體效應產生的幼體漂浮行為強度可能與母體接受的刺激時間相關。在輪蟲接受較長時間刺激后,則可通過母體效應將這種刺激傳遞給后代,使后代產生更加強烈的行為響應。

在實驗三中,我們研究了萼花臂尾輪蟲母體在捕食者誘導液中暴露時間與后代形態的關系。與前人的研究結果類似,母體在晶囊輪蟲誘導液中暴露時間越長,后代的形態響應則越強烈。綜合前述行為實驗,我們認為輪蟲可通過母體效應使后代產生更顯著的形態和行為反捕食響應,因此,當萼花臂尾輪蟲與捕食者共存在時,共同采用兩種響應方式可能提高輪蟲幼體的生存率。

許多生物可通過改變形態或行為降低捕食者威脅[39,40]。目前已知包括軟體動物、魚類、兩棲動物及一些陸生動物等均可產生行為或形態反捕食響應[7,41-43]。這些響應除了改變生物自身的形態或行為特征,還可改變生物與捕食者的種間關系,最終通過上行或下行效應影響食物網甚至生態系統[39,44]。近年來隨著氣候變化加劇,極端天氣增加,種間關系可受到氣候變化影響,在不同生物間形成資源錯配[45]。例如,橈足類和輪蟲對氣候變化的適應程度不同,升溫可加強橈足類對輪蟲的攝食作用,降低輪蟲在水體中的豐度[46]。在不利條件下,與形態響應相比,行為響應發生時間較短,在外界環境改變或者恢復后,行為響應可迅速逆轉,因此行為響應對于生物適應不利環境具有重要意義[47]。在特定情況下,生物通過行為響應,逃離捕食者或渡過不利環境后,才有機會產生形態或者生活史響應[48]。在極端氣候增加的情況下,行為響應可能是決定生物體能否生存的關鍵響應。本文首次發現輪蟲可通過母體效應產生反捕食行為響應,這一結果也顯示輪蟲對不利的外部條件具有更靈活的適應能力,為未來的種間關系與母體效應的聯系研究提供了基礎。

4 結論

本研究在萼花臂尾輪蟲的反捕食漂浮行為研究基礎上,首次通過實驗研究了輪蟲母體效應與反捕食漂浮行為的關系。發現:(1)經捕食者誘導液處理較長時間后的母體,無論是否帶卵,再放入普通培養液后,產生的幼體當暴露于同種捕食者誘導液時,產生的漂浮行為響應比沒有經捕食者誘導液處理的母體產生的幼體更強烈;(2)母體于捕食者誘導液中暴露時間越長,后代反捕食行為響應與形態響應均更加強烈。在未來的種間關系研究中,可以進一步研究捕食者密度、與母體共存時間及其他如氣候變化等環境因素對輪蟲反捕食行為母體效應的影響,以及這種響應對輪蟲自身種群結構及其與環境互動的影響。