葡萄糖醛酸改性樹脂對膽紅素的吸附研究

滕 敏， 鄭瓊鳳， 侯光陽， 蒙柳歡， 岑超峰， 李晨曦， 周 亶， 肖文香

(桂林電子科技大學 生命與環境科學學院，廣西 桂林 541004)

血液凈化是一種重要的治療方式。當發生藥物中毒或肝臟衰竭時，人體內積累的毒素會對病人的生命健康造成嚴重威脅。膽紅素是一種內源性毒素，如果肝功能出現障礙，膽紅素代謝異常，將使血液中的游離膽紅素濃度升高。游離膽紅素具有脂溶性，該特點使其可以很容易透過細胞膜和大腦屏障，沉積于腦組織，造成大腦損傷甚至死亡[1-2]。因此，在對高膽紅素患者治療過程中，采取適當的方式及時破壞或去除血液中過量的膽紅素尤為重要。

通過血液灌流法去除人體內毒素的基本原理是采用特定吸附劑來吸附血液中的有害物質。血液灌流法是臨床普遍使用的一種血液凈化方法[3-4]。對于血液中過量膽紅素的去除，商品化的吸附柱主要是由樹脂類吸附劑構成。很顯然，開發并使用合適的吸附劑是提高血液灌流治療效率的關鍵環節。早期的膽紅素吸附劑為活性炭[5]，目前新型膽紅素吸附劑材料有介孔硅、多孔碳、碳納米管等[6-8]，主要利用了這些材料的比表面積高、吸附容量大等優點。人工合成的高分子樹脂材料如大孔吸附樹脂在血液灌流中應用廣泛，其特點是機械強度高、成本較低，可對吸附的骨架及孔徑等進行針對性設計，具有較好的商用價值。然而，目前樹脂吸附劑存在吸附容量不夠大、生物相容性不足等缺點，影響了其臨床應用[9-10]。由于膽紅素分子具有親脂疏水性以及含有羧基基團，可以在吸附劑結構中引入具有疏水作用、靜電作用或氫鍵作用的功能團，以提高樹脂吸附劑對膽紅素的親和性。如離子交換樹脂吸附柱的原理主要是通過靜電作用實現對膽紅素的吸附，苯乙烯系列的大孔樹脂可通過疏水作用與膽紅素結合。為了提高吸附劑的吸附容量，可以在吸附劑中引入多維孔道結構，如摻雜多孔碳、石墨烯，通過引入的微孔-介孔結構提高了吸附劑的比表面積及膽紅素的吸附容量，同時孔道結構可促使膽紅素在吸附劑中快速擴散，有助于加快吸附速率[11-12]。生物相容性、選擇性也是吸附劑的重要參數，通常采用表面改性的方式來改善吸附劑的生物相容性和對膽紅素的親和性，如引入兩性離子聚羧基甜菜堿、聚乙烯基吡咯烷酮、人血清白蛋白、酰胺基、胺基等功能基團[13-17]。

葡萄糖醛酸化作用是毒素、藥物等從人體內清除、解毒的主要途徑[18-19]。作為一種內源性毒素，游離膽紅素進入肝臟之后，在UDP-葡萄糖醛酸基轉移酶的催化作用下與葡萄糖醛酸結合，轉變成水溶性的無毒直接膽紅素。采用葡萄糖醛酸化作用對材料進行改性，也是提高材料水溶性、生物相容性的有效手段[20-25]，如鏑摻雜的羥基磷灰石納米材料可以用于磁共振醫學成像，但納米材料的毒性效應限制了其應用，羥基磷灰石納米材料經葡萄糖醛酸功能化后，其毒性大為降低，生物相容性增強，有望用于磁共振雙模成像[25]。本研究中膽紅素吸附劑的設計思路是模擬上述葡萄糖醛酸化的生理過程，采用葡萄糖醛酸對大孔樹脂進行改性，吸附劑中引入葡萄糖醛酸后，一個葡萄糖醛酸分子中含有4個羥基，可以為膽紅素提供多個結合位點，以實現對膽紅素的快速、選擇性吸附。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

膽紅素及D-葡萄糖醛酸、人血清白蛋白(HSA)、AB-8聚苯乙烯大孔吸附樹脂(粒徑300～1 250 μm)分別購自上海麥克林生化試劑公司、Sigma化學試劑公司及安徽三星樹脂科技有限公司。實驗中用到的其它分析純試劑，如CH2Cl2、(CH2)4O(THF)、CH3OH、氯乙酰氯、三氯化鋁、三乙基芐基氯化銨(TEBA)、二乙烯三胺及四乙烯五胺等為阿拉丁試劑公司產品。

吸附前后溶液的吸光度用Hitachi UH5300紫外可見分光光度計測定，吸附劑的特征基團吸收則用Bruker Tensor 27紅外光譜儀測定。

1.2 葡萄糖醛酸改性樹脂的制備

1.2.1 氯乙酰化樹脂的制備

將5 g AB-8大孔樹脂經50 ml無水乙醇溶脹4 h、洗滌5次后，再用常溫水及熱蒸餾水各洗滌2次，洗去聚苯乙烯微球中殘留的反應試劑，之后真空干燥備用。在三口燒瓶中加入2 g預處理好的AB-8樹脂和30 ml的CS2，攪拌5 min，溶脹12 h后，攪拌下加入2.5 mL氯乙酰氯溶液、2 g AlCl3固體，此時微球顏色加深，呈紅黑色，46 ℃反應4 h。反應結束后，將樹脂微球用無水乙醇洗至微黃色，用3%的冷HCl中和至中性，再用蒸餾水洗滌過濾至濾液不含Cl—(加入AgNO3溶液無白色絮狀沉淀產生)，最后用CH3OH洗滌過濾3次，真空干燥備用。

1.2.2 多乙烯多胺化樹脂的制備

在三口燒瓶中加入2 g氯乙酰化樹脂和20 ml甲苯，攪拌5 min使其分散均勻，接著溶脹3 h，滴加2.5 mL的二乙烯三胺或四乙烯五胺試劑，90 ℃加熱8 h，將溶液冷卻至室溫，將樹脂水洗至中性，再分別用無水C2H5-OH洗、蒸餾水洗3次，胺化后的樹脂球顏色呈黃色，真空干燥備用。

1.2.3 葡萄糖醛酸對樹脂的改性

通過酰胺化反應將葡萄糖醛酸接枝到樹脂球上。將D-葡萄糖醛酸(30 mg)、EDC(30 mg)和NHS(45 mg)溶于30 mL蒸餾水，37 ℃活化15 min，再加入2 g上述胺化樹脂，4 ℃反應48 h，得到黃褐色樹脂球，經過用水洗、無水乙醇洗3次，真空干燥備用。

各種吸附劑及其簡稱分別為：聚苯乙烯大孔吸附樹脂(PS)、氯乙酰化樹脂(PS-Cl)、二乙烯三胺化吸附樹脂(PS-DETA)、四乙烯五胺化吸附樹脂(PS-TEPA)、葡萄糖醛酸改性的二乙烯三胺化吸附樹脂(Glu-DETA)、葡萄糖醛酸改性的四乙烯五胺化吸附樹脂(Glu-TEPA)。

1.3 葡萄糖醛酸改性樹脂對膽紅素的吸附

膽紅素存在分子內氫鍵，導致其在水相中的溶解性不佳，在堿性條件下由于氫鍵被破壞而易于溶解，因而膽紅素粉末先用少量0.02 mol/L的氫氧化鈉溶液完全溶解，再用10 mmol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液定容，得到用于吸附實驗的膽紅素溶液。

在使用前先用生理鹽水將吸附劑潤濕。將一定體積濃度為C0的膽紅素溶液(和一定質量的改性大孔吸附樹脂混合，恒溫振蕩(90 r/min) 25 min，測定的膽紅素溶液的吸光度值為438 nm，運用吸光度標準曲線計算得到吸附后膽紅素的濃度C，計算吸附劑對膽紅素的吸附量：

Q=(C0-C)V/m，

(1)

平行測定3次，同時進行空白對照實驗，減去空白吸附量。

2 結果與討論

2.1 葡萄糖醛酸改性樹脂的制備與表征

相關研究表明，在吸附劑中引入羧基、氨基、羥基等功能基團作為配基有利于膽紅素吸附[9,16]。以AB-8型大孔樹脂作為吸附劑載體，在吸附劑上接枝葡萄糖醛酸功能團，增強吸附劑對膽紅素的選擇性作用。采用傅克法對樹脂進行酰基化反應，對樹脂上的苯環進行氯乙酰化，再與二乙烯三胺或四乙烯五胺反應，在樹脂中引入多個胺基基團，最后通過酰胺化反應將葡萄糖醛酸分子接枝上去，得到改性樹脂。改性樹脂中含有豐富的—NH—、—OH基團，可作為膽紅素的吸附位點，通過氫鍵作用與膽紅素結合，吸附劑的制備及與膽紅素的作用如圖1所示。

圖1 葡萄糖醛酸改性樹脂的制備及其與膽紅素的結合作用

圖2 各種吸附劑的紅外光譜圖

2.2 改性樹脂對膽紅素的吸附作用

為了說明改性對膽紅素吸附的作用，在m=20 mg，C0=0.1 mg/mL，t=25 min條件下，研究了6種樹脂吸附劑對膽紅素的吸附效果，如圖3所示。相同條件下，未經功能化的大孔聚苯乙烯樹脂(PS)，其膽紅素的吸附量和吸附率最低。經過多胺基功能化后，樹脂對膽紅素的吸附量和吸附率均比未功能化的PS高，其中四乙烯五胺化樹脂(PS-TEPA)對膽紅素的吸附效果優于二乙烯三胺化樹脂(PS-DETA)，這表明-NH基團含量越高，與膽紅素的結合位點越多，其吸附效果越好。在多胺基功能化的基礎上繼續引入了葡萄糖醛酸基團，吸附劑表面增加了能與膽紅素結合的—OH基團，因而其吸附性能得到了明顯提升。相比于對應的多胺化樹脂，Glu-DETA、Glu-TEPA樹脂對膽紅素的吸附量分別提高了31.2%、37.1%，與未功能化的PS相比，則分別提高61.5%、84.6%。相比于Glu-DETA樹脂，Glu-TEPA樹脂的吸附量提高了14.2%。由此可見，通過向吸附劑中引入具有多個膽紅素結合位點的功能分子，是提高膽紅素吸附劑性能的有效途徑。Glu-TEPA樹脂對膽紅素的吸附量最高。

圖3 不同改性樹脂對膽紅素的吸附效果

2.3 吸附時間與吸附動力學

吸附平衡時間是影響吸附劑實際應用價值的一個重要指標。吸附時間對膽紅素吸附的影響如圖所示，其中，m=20 mg，T=37 ℃。從圖4可看出，Glu-TEPA改性樹脂對膽紅素的吸附平衡時間為25 min。到達吸附平衡之前(t<25 min)，隨著吸附時間的增加，Glu-TEPA樹脂對膽紅素的吸附量線性增大。到達吸附平衡之后(t>25 min)，延長吸附時間，吸附量基本不變。膽紅素在大孔樹脂上的吸附，先以擴散作用通過吸附劑表面的液膜，進入顆粒內表面，再到達活性吸附位點。

圖4 吸附時間對膽紅素吸附的影響

圖5 改性樹脂對膽紅素的二級吸附動力學曲線

圖5為m=20 mg，C0=0.1 mg/mL，T=37 ℃時改性樹脂對膽紅素的二級吸附動力學曲線，其擬合方程為t/Q=0.044t+ 0.042，相關系數R2=0.999，說明二級動力學模型可以較好地描述膽紅素在Glu-TEPA樹脂上的吸附行為，即膽紅素主要是通過其分子中的—COOH、—NH基團與吸附劑中的—OH、—NH基團之間的化學作用而被吸附。

2.4 膽紅素初始濃度對吸附劑吸附性能的影響與吸附等溫線

為了探討Glu-TEPA對膽紅素的吸附機理，對膽紅素的吸附平衡進行了研究。在m=20 mg，T=37 ℃時，Glu-TEPA樹脂對不同濃度的膽紅素吸附30 min后，測定清液的濃度并計算吸附量，結果如圖6所示。當濃度較低時(C0<0.15 mg/mL)，Glu-TEPA樹脂對膽紅素的吸附量與其初始濃度成正比；當膽紅素濃度大于0.15 mg/mL時，Glu-TEPA對膽紅素的吸附量基本不變，說明Glu-TEPA中的吸附位點已經飽和，無法進一步吸附膽紅素。最佳吸附條件下，Glu-TEPA樹脂對膽紅素的飽和吸附量34.5 mg/g。

圖6 初始濃度對膽紅素吸附的影響

在m=20 mg,T=37 ℃時，吸附劑對不同濃度的膽紅素進行吸附，達到吸附平衡后，測定膽紅素的平衡濃度Ce，并計算平衡吸附量Qe，對實驗結果分別采用Langmuir和Freundlich等溫吸附式來研究膽紅素在改性樹脂吸附劑表面的吸附行為，得到改性樹脂對膽紅素的吸附等溫曲線，如圖7所示。從圖7得出，Langmuir模型(圖7(a))的擬合方程為Ce/Qe=0.028Ce + 0.086，相關系數R2=0.997; Freundlich模型(圖7(b))的直線擬合方程為lgQe=0.33lgCe + 0.94，相關系數R2=0.53。從相關系數可知，Glu-TEPA樹脂對膽紅素的等溫吸附平衡實驗擬合結果與Langmuir模型吻合較好，擬合方程說明膽紅素分子是以單分子層的形成吸附在樹脂上的表面。根據Langmuir等溫線方程的斜率，計算得到Glu-TEPA樹脂對膽紅素的理論飽和吸附量為35.7 mg/g，實際測得的吸附量為34.5 mg/g，實測值與理論值較為接近。

圖7 改性樹脂對膽紅素的Langmuir和Freundlich吸附等溫曲線

2.5 其他因素對膽紅素吸附的影響

實驗還研究了吸附溫度、溶液的離子強度以及人血清白蛋白共存時對膽紅素吸附的影響。

研究了20～48 ℃溫度范圍內吸附劑對膽紅素的吸附，結果如圖8所示。當溫度位于20～30 ℃之間時，吸附量基本不變，當溫度大于30 ℃時，吸附量開始持續增大，直到37 ℃時達到頂峰，可能是升溫加快了擴散過程；然而溫度繼續升高，吸附量有所下降，原因可能是高溫會對Glu-TEPA樹脂與膽紅素之間的結合作用，比如氫鍵作用，造成破壞，導致吸附量降低。總體來說，Glu-TEPA樹脂在室溫及生理溫度條件下，均對膽紅素具有良好的吸附效果。

圖8 溫度對膽紅素吸附的影響

血液的pH值范圍為7.35～7.45，當發生酸中毒或堿中毒時，pH會偏離上述范圍。實驗研究了當溶液的pH值為6.8、7.4和8.0時，Glu-TEPA樹脂對膽紅素的吸附效果，從圖9可知，pH變化對膽紅素的吸附影響不大，在生理pH條件下，吸附效果最優。

圖9 pH對膽紅素吸附的影響

圖10 離子強度對膽紅素吸附的影響

通過改變NaCl濃度來改變吸附溶液的離子強度，隨著NaCl濃度升高，膽紅素吸附量有所下降，NaCl濃度從0.01 mol/L增大至0.05 mol/L，吸附量下降了約4.2% (圖10)。原因可能在于，pH=7.4時，膽紅素分子中的羧基解離帶負電，導致其周圍聚集了很多正離子，阻礙了膽紅素與Glu-TEPA樹脂中吸附位點的結合，使得膽紅素吸附量下降。

在研究人血清白蛋白共存對膽紅素吸附的影響時，由于正常成人血漿白蛋白值濃度范圍為35～50 g/L，當蛋白質合成發生障礙時，白蛋白濃度下降。實驗研究了白蛋白濃度范圍為0～50 g/L時， Glu-TEPA樹脂對膽紅素的吸附效果，從圖11可知，隨著白蛋白濃度的增大，膽紅素的吸附量呈下降趨勢。當0.1 mg/mL膽紅素與50 g/L的人血清白蛋白共存時，Glu-TEPA樹脂對膽紅素的吸附量下降了6.5%。人血清白蛋白的存在對膽紅素的吸附效果有所減弱，因為人血清白蛋白與膽紅素有高親和位點[22]，高濃度的血清白蛋白與膽紅素形成復合物，與Glu-TEPA樹脂與膽紅素的結合作用形成競爭關系。此外，膽紅素-清蛋白復合物的形成使得分子體積增大，使膽紅素往吸附樹脂的內部空隙進行滲透增加了困難，造成吸附量下降。總體而言，HSA對Glu-TEPA與膽紅素之間的吸附作用影響不大。

圖11 血清白蛋白對膽紅素吸附的影響

3 結束語

利用仿生原理，模擬體內游離膽紅素與葡萄糖醛酸的結合作用，采用葡萄糖醛酸對大孔吸附樹脂進行改性得到膽紅素吸附劑。葡萄糖改性的大孔樹脂吸附劑對膽紅素具有良好的吸附效果，吸附速度快，生理濃度范圍內的人血清白蛋白基本不影響膽紅素的吸附。