未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p、KLF5表達水平及臨床意義

薛誠 馬駿

顱內動脈瘤是一種對人類健康危害嚴重的腦血管疾病[1]。隨著老齡化的加劇及血管成像檢查的普及，未破裂顱內動脈瘤在越來越多的老年病人中被檢出[2]。炎性反應介導的血管破壞及重構是導致動脈瘤形成、進展及破裂的重要機制[3-4]。Krüpple樣因子5(krüppel-like factor 5，KLF5)在血管生成、細胞增殖、遷移及炎癥等血管重構過程中發揮重要作用[5-6]。miR-448-3p可通過下調KLF5介導的炎癥反應，進而抑制大鼠顱內動脈瘤的進展[7]。本研究檢測未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p、KLF5表達水平，分析兩者與病人臨床特征及體內炎癥水平的關系。

對象與方法

一、對象

2017年9月～2020年5月本院收治的未破裂顱內動脈瘤病人143例為觀察組。納入標準：(1)初次確診，經核磁共振血管成像或腦血管造影診斷為未破裂顱內動脈瘤；(2)病人知情并簽署知情同意書；(3)獲得本院倫理委員會批準。排除標準：合并其他腫瘤、傳染性疾病、感染性疾病及其他嚴重臟器疾病；有嚴重頭部外傷史、腦血管卒中病史者；臨床資料不完整。同期體檢健康者150例為對照組，均經核磁共振血管成像或腦血管造影確定無顱內動脈瘤。兩組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 兩組一般資料比較

二、方法

1.材料：SYBR Green qRT-PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；人IL-6、TNF-α酶聯免疫(ELISA)試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司；ABI 7500型熒光定量PCR儀購于美國Applied Biosystems公司；ELX800型全自動酶標儀購于美國BIO-TEK公司。

2.血液采集及指標檢測：未破裂顱內動脈瘤病人入院時、體檢者體檢時抽取靜脈血5 ml，4 ℃ 4 000 r/min離心10分鐘，留取上層血清，分裝、置于-80 ℃冰箱保存。血清miR-448-3p、KLF5 mRNA表達水平檢測：將血清樣品置于冰上融化，用TRIzol法提取總RNA。以RNA樣本為模板，反轉錄合成cDNA，反應條件：37 ℃ 16分鐘，84 ℃ 6秒。取cDNA樣本為模板，在熒光定量PCR儀上進行qRT-PCR反應，miR-448-3p、KLF5 mRNA表達結果以2-ΔΔCt相對定量法表示，反應條件：96 ℃ 2分鐘，96 ℃變性15秒，62 ℃退火30秒，70 ℃延伸10秒，共36個循環。miR-448-3p正向引物：5′-TTATTGCGATGTGTTCCTTATG-3′，逆向引物：5′-ATGCATGCCACGGGCATATACACT-3′；KLF5正向引物:5′-GCTCGCTAGCCTCGAAAGCTAAACGCAATGTCATTTTT-3′，逆向引物：5′-ATGCCTGCAGGTCGACTGTGTCTCACTGTGTATTACATGC-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，逆向引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin正向引物：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，逆向引物：5′-AATGCTATCACCTCCCCTGTGT-3′。血清炎癥水平檢測：將血清樣品置于冰上融化，使用IL-6、TNF-α ELISA試劑盒分別進行檢測，具體操作按試劑盒說明書進行，在加終止液后的10分鐘之內，使用酶標儀(450 nm)測定吸光度(optical density，OD)值，根據IL-6、TNF-α標準液的OD值分別繪制標準曲線，根據血清樣品的OD值計算血清IL-6、TNF-α水平。

三、統計學分析

表2 血清miR-448-3p、KLF5 mRNA水平與臨床特征的關系

結果

1.兩組血清miR-448-3p、KLF5 mRNA表達水平比較：觀察組和對照組血清miR-448-3p分別為(0.78±0.15)vs (1.26±0.17)，KLF5 mRNA方便為(2.17±0.24)和(1.35±0.18)，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p、KLF5 mRNA表達水平與臨床特征的關系見表2。結果表明，不同年齡、性別、瘤位置的未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p、KLF5 mRNA水平差異無統計學意義(P>0.05)；與瘤數目=1個相比，瘤數目≥2個的未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p水平顯著降低，KLF5 mRNA水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與瘤直徑<7 mm相比，瘤直徑≥7 mm的未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p水平顯著降低，KLF5 mRNA水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

3.對照組與觀察組血清炎癥水平比較：觀察組與對照組血清IL-6分別為(118.54±8.14)mmol/L 和(34.65±6.23)mmol/L，TNF-α分別為(610.12±34.15)mmol/L 和(136.32±16.38)mmol/L，兩組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

4.未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p、KLF5 mRNA表達水平與炎癥水平的相關性：相關性分析顯示，未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p與IL-6、TNF-α水平均呈負相關(r=-0.442、-0.471，P<0.05)，血清KLF5 mRNA與IL-6、TNF-α水平均呈正相關(r=0.454、0.523，P<0.05)。

5.未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p水平與KLF5 mRNA水平的相關性：相關性分析結果顯示，未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p水平與血清KLF5 mRNA水平呈負相關(r=-0.429，P<0.05)。

6.血清miR-448-3p、KLF5 mRNA水平對未破裂顱內動脈瘤的診斷分析：ROC分析結果顯示，血清miR-448-3p表達水平的ROC曲線下面積為0.978(95%CI：0.965～0.990)，截斷值為1.00，敏感度為93.7%，特異性為90.7%，約登指數為0.944；血清KLF5 mRNA表達水平的ROC曲線下面積為0.995(95%CI：0.991～1.000)，截斷值為1.77，敏感度為95.8%，特異性為98.7%，約登指數為0.945。見圖1。

圖1 ROC分析血清miR-448-3p、KLF5 mRNA水平對未破裂顱內動脈瘤的診斷價值

討論

顱內動脈瘤是指顱內動脈在先天性肌層缺陷、后天獲得性內彈力層變性、血流動力學負荷等因素作用下，顱內動脈管腔逐漸異常擴張、膨出，是一種常見的腦血管疾病，常發于顱底動脈分叉處[8]。顱內動脈血管平滑肌細胞形成的細胞外基質與內彈性層在產生、降解之間的不平衡，會導致腦血管炎癥，進而誘導顱內動脈瘤的形成、生長及破裂，因此認為腦血管炎癥是誘發顱內動脈瘤形成、生長、破裂的重要因素[9]。本研究亦顯示，觀察組未破裂顱內動脈瘤病人血清IL-6、TNF-α水平較對照組顯著升高，表明炎癥反應參與未破裂顱內動脈瘤發生，與上述研究結果基本一致，進一步說明炎癥反應是導致未破裂顱內動脈瘤發生的主要因素。

未破裂顱內動脈瘤發生破裂會引起顱內出血，導致嚴重并發癥，具有較高的潛在致死、致殘風險。盡管僅有少部分病人會出現破裂，但探索影響未破裂顱內動脈瘤形成、生長及破裂的因素以便及時予以積極預防或治療，仍具有重要意義。miRNA是在生物體中調控發育、分化、衰老等生物學過程的重要分子，能調控血管炎癥，可能在動脈瘤形成及發展中起重要作用[10-11]。秦浩等[12]研究發現，未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-126表達升高，miR-125b表達降低，檢測miR-126、miR-125b表達水平有助于判斷未破裂顱內動脈瘤的數目和直徑。張建忠等[7]研究表明，miR-448-3p可以抑制顱內動脈瘤的進展。本研究顯示，觀察組未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p水平較對照組顯著降低，其水平與病人的年齡、性別、瘤位置無顯著關系，但在不同瘤數目、瘤直徑病人中差異顯著，即血清miR-448-3p水平與瘤數目、瘤直徑關系密切，表明miR-448-3p參與未破裂顱內動脈瘤發生及生長。本研究顯示，未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p水平與血清IL-6、TNF-α水平呈負相關，表明miR-448-3p在未破裂顱內動脈瘤中的表達與炎癥反應關系密切。

KLF5是含有鋅指結構的、能調控DNA轉錄的轉錄因子，在炎癥因子刺激下，能激活炎癥反應信號通路，進一步加重炎癥反應，能在血管重塑過程中發揮重要作用。莊紅等[13]研究表明，沉默KLF5能通過抑制NF-κB通路，減少氧化應激條件下的心肌細胞炎癥因子分泌。張曼莉等[14]研究表明，KLF5能與NF-κB p50相互作用，對高糖誘導血管平滑肌細胞炎癥反應起促進作用。周靜等[6]研究表明，桑黃素能改善糖尿病血管的炎性病變，其機制與抑制KLF5表達有關。本研究顯示，觀察組未破裂顱內動脈瘤病人血清KLF5 mRNA水平較對照組顯著升高，其水平在不同瘤數目、瘤直徑病人中差異顯著，表明KLF5參與未破裂顱內動脈瘤的形成、生長。進一步相關性分析結果表明，未破裂顱內動脈瘤病人血清KLF5 mRNA水平與血清IL-6、TNF-α水平呈正相關，與血清miR-448-3p水平呈負相關，表明KLF5參與未破裂顱內動脈瘤病人體內的炎癥反應，且與miR-448-3p表達關系密切。ROC曲線評估結果顯示，血清miR-448-3p、KLF5 mRNA表達水平診斷未破裂顱內動脈瘤的ROC曲線下面積分別為0.978、0.995，敏感度分別為93.7%、95.8%，特異性分別為90.7%、98.7%，均具有一定診斷價值。

綜上所述，未破裂顱內動脈瘤病人血清miR-448-3p水平升高，KLF5 mRNA水平降低，兩者關系密切，可能共同調控體內炎癥反應，影響未破裂顱內動脈瘤進展。