饑餓脅迫對日本蟳抗氧化酶活性和細胞超微結構的影響

丁愛俠

饑餓脅迫對日本蟳抗氧化酶活性和細胞超微結構的影響

丁愛俠

（寧波大學 土木與環境工程學院, 浙江 寧波 315211）

日本蟳()隸屬于梭子蟹科、蟳屬, 浙江俗稱“石蟹”“石奇角”和“石蜞螃”, 在日本、朝鮮、馬來西亞等國家廣泛分布, 國內渤海、黃海、東海、南海等海域也有分布. 因其營養價值高、肉味鮮美, 深受消費者喜愛, 具有較高的經濟價值[1-2]. 然而, 近年來海洋日本蟳產量越來越少, 人工增養殖、人工放流逐漸成為餐桌上日本蟳的主要來源. 因此, 日本蟳基礎生物學的研究成為日本蟳增養殖產業化發展以及人工放流規模擴大的重要理論支撐.

自然放流環境、養殖環境以及運輸過程中的水生生物很容易受到饑餓的脅迫, 體內免疫系統和細胞結構發生改變, 對各種病原生物的抵抗力降低, 從而導致疾病暴發. 國內外學者先后研究了饑餓脅迫對藍鰓魚、克氏原螯蝦、羅非魚、刀鱭、團頭魴、猛蝦蛄等水生動物抗氧化酶活性和器官組織結構的影響[3-8]. 但是, 國內外關于環境脅迫對于日本蟳免疫系統和細胞結構、功能影響的研究成果相對較少, 尚未見到饑餓脅迫對日本蟳組織細胞和酶活性影響的相關報道.

本研究選擇超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)作為研究指標, 通過試驗探討日本蟳在饑餓脅迫下體內抗氧化酶活性的變化, 分析日本蟳生理調節機制. 同時運用組織學試驗方法, 對日本蟳鰓、肌肉、肝胰腺、心臟的細胞超微結構進行拍照, 觀察16d饑餓脅迫后細胞結構的變化, 為加強日本蟳健康養殖調控、改進活體運輸技術以及豐富日本蟳生態學理論研究提供試驗數據支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

日本蟳購自寧波象山碼頭, 共200只, 雌雄各半, 規格整齊((6.8～7.2)cm×(4.6～5.3)cm). 日本蟳購入后放入生態循環養殖系統暫養, 試驗所用海水為鄞州育苗場經沉淀和過濾后的清潔海水, 鹽度2.0%, 水溫10℃, 自然光照, 連續充氣. 暫養期間每日2次投喂新鮮貝類, 并仔細觀察, 淘汰缺少活力的個體, 暫養7d后開始饑餓脅迫試驗.

1.2 試驗設計

饑餓脅迫試驗養殖條件、養殖方法同暫養, 本試驗設2個對照組和2個饑餓組, 每組隨機放入30只預先挑選出來的體態正常、健康、活力強的個體, 雌雄各半. 對照組正常投喂新鮮貝類, 饑餓組不投餌. 16d后終止試驗.

1.3 試驗方法

1.3.1 抗氧化酶活性的測定

對照組和饑餓組每4d取樣1次, 每次取2～3只, 迅速置于冰盤內活體解剖, 分別取出鰓、肝胰腺、心臟和肌肉, 用生理鹽水沖洗后放入-70℃冰箱備用. 測定時準確稱量0.1g組織樣品, 加入0.5mL磷酸鹽緩沖液(pH=7.0), 放入玻璃勻漿器, 在冰浴條件下勻漿5min, 然后放入冷凍離心機內以14000r·min-1的速度離心25min, 取上清液用于酶活性測定.

SOD活性測定采用氮藍四唑光化學反應法[9]. 3mL反應液中含50mmol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.8) 1.5mL, 130mmol·L-1甲硫氨酸(met)溶液0.3mL, 0.75mmol·L-1氯化硝基四氮唑蘭(NBT)溶液0.3mL, 0.1mmol·L-1EDTA-Na2液0.3mL和組織上清液0.1 mL, 最后加0.02mmol·L-1核黃素0.3mL. 置于4000lx日光下進行光化學反應, 反應溫度20℃, 30min后用黑暗終止反應, 并立即使用DR5000分光光度計(哈希, 美國)在560nm的波長下測吸光度. 一個SOD活力單位定義為能引起反應初速度(指不加酶時)半抑制時的酶用量. CAT活性測定采用紫外吸收法. 3mL反應液中含0.2mol·L-1磷酸緩沖液(pH=7.0) 1.5mL, 組織上清液0.2mL和0.1mol·L-1H2O20.3mL. 混合后即于240nm的波長下測吸光度, 然后置于25℃水浴中反應5min, 再置于240nm下測定吸光度. 根據前后吸光度的差值計算CAT活性, 以1min內吸光度減少0.1的酶量為1個酶活單位. 每組樣品各設置4個平行.

1.3.2 電鏡觀察

對解剖獲得的鰓、肌肉、肝胰腺和心臟組織迅速用2.5％戊二醛和1％鋨酸雙固定, 梯度乙醇脫水, Epon812環氧樹脂包埋, 以LKB-3型超薄切片機(LKB, 瑞典)切片, 醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色, 用H-700型透射電鏡(日立, 日本)觀察并攝影.

1.4 數據分析

采用SPSS 17.0統計軟件分析酶活性數據, 采用均值Duncan法進行差異性比較, 顯著水平設為<0.05.

2 試驗結果

2.1 饑餓脅迫對日本SOD和CAT活性的影響

試驗結果表明兩種抗氧化酶在日本蟳體內的分布具有組織差異性. SOD酶的活性大小順序為: 心臟>鰓>肌肉>肝胰腺, CAT活性為肝胰腺>心臟>鰓>肌肉. 兩種酶在饑餓脅迫下表現出不同的應激反應.

饑餓脅迫對日本蟳SOD活性的影響見表1. 鰓組織中SOD活性在饑餓脅迫第4d開始增加, 第8d顯著降低, 第12d又快速升高, 并在試驗結束前保持一個穩定的高水平. 肝胰腺組織中SOD活性在饑餓脅迫的前8d內較對照組有輕微的下降, 第12d突然升高, 并達到峰值后穩定至試驗結束. 心臟和肌肉組織中SOD活性總體受到饑餓脅迫的影響相對較小, 其中心臟組織中SOD活性在饑餓脅迫下呈現比較明顯的刺激作用, 肌肉組織中SOD活性在第4d表現出輕微的抑制作用, 從第8d開始到結束一直維持在刺激狀態. 總體看來, 饑餓脅迫會讓日本蟳機體內SOD活性表現出一定的刺激效應, 并且在第12d達到峰值.

表1 饑餓脅迫對日本SOD活性的影響

注: 數據為平均值±標準偏差, 不同上標字母表示同一組織中存在顯著性差異(<0.05). 下表同.

饑餓脅迫對日本蟳CAT活性的影響見表2. 鰓中CAT活性在試驗期間的波動較小, 且整體表現出輕微的抑制作用. 肝胰腺中CAT活性對饑餓的反應比較敏感, 試驗第4d出現明顯的抑制作用, 酶活性只有對照組的40%, 第8d開始快速增加達到峰值, 12d恢復并接近對照組的水平, 第16d酶活性略有回升. 饑餓脅迫第4d肌肉CAT酶活性出現明顯的應激反應, 升高到對照組的2倍, 其余時間基本保持在對照組水平. 饑餓對心臟CAT活性影響相對較小, 16d內基本維持在對照組水平.

表2 饑餓脅迫對日本CAT活性的影響

2.2 饑餓脅迫對日本組織超微結構的影響

如圖1所示, 對照組日本蟳鰓絲管壁比較厚, 由上皮細胞構成, 外層為角質層; 細胞質中內質網、線粒體都十分豐富; 細胞核規則, 核膜清楚, 異染色質豐富、染色深. 饑餓脅迫組日本蟳鰓絲的管壁輕微變薄; 部分鰓絲出現輕微腫脹; 線粒體部分解體, 但仍有一部分比較完整, 內嵴水腫、解體, 并有空泡化現象出現; 內質網和細胞核都比較完整.

(a) 對照組鰓絲細胞(×2000); (b) 饑餓組鰓絲細胞(×2000); (c) 對照組鰓絲管壁角質層(×8000); (d) 饑餓組角質層(×25000); (e) 對照組線粒體及內嵴(×15000); (f) 饑餓組線粒體(×20000); (g) 對照組細胞核及核膜(×4000); (h) 饑餓組細胞核及核膜(×6000); (i) 對照組內質網(×15000); (j) 饑餓組內質網(×20000). M: 線粒體; Cr: 線粒體內嵴; NM: 細胞核核膜; N: 細胞核; ER: 內質網.

如圖2所示, 對照組日本蟳肝胰腺肝管微絨毛豐富、排列致密; 線粒體靠近微絨毛區分布, 內嵴發達; 細胞質中粗面內質網和滑面內質網十分豐富, 滑面內質網呈環狀排列; 細胞核規則, 結構完整, 核膜清晰; 脂肪滴電子密度均勻. 饑餓組日本蟳肝胰腺細胞器溶解得比較多, 空泡化比較嚴重. 部分肝管的微絨毛出現退化現象, 排列不致密, 不規則, 部分缺失; 線粒體比較豐富、完整, 結構清楚; 內質網數量仍然豐富, 但部分內質網出現水腫、擴張, 嵴有輕微破壞; 細胞核不規則, 染色質減少、空泡化; 脂肪滴邊緣出現裂紋.

(a) 對照組肝管微絨毛(×8000); (b) 饑餓組肝管微絨毛(×10000); (c) 對照組線粒體(×10000); (d) 饑餓組線粒體(×10000); (e)對照組內質網(×3000); (f) 饑餓組內質網(×3000); (g) 對照組細胞核及核膜(×6000); (h) 饑餓組細胞核及核膜(×4000); (i) 對照組脂肪滴(×2500); (j) 饑餓組脂肪滴(×3000). Mv: 肝管微絨毛; M: 線粒體; ER: 內質網; NM: 細胞核核膜; N: 細胞核; Li: 脂肪滴.

如圖3所示, 對照組日本蟳心臟心肌細胞排列規則、致密, 明暗帶清晰; 線粒體和內質網豐富, 結構完整; 細胞核規則, 核膜清晰、完整, 異染色質豐富, 染色較深; 核糖體豐富. 16d饑餓脅迫后日本蟳心臟細胞超微結構出現輕微的變化. 肌原纖維排列有些疏松, 明暗帶模糊; 線粒體部分解體, 空泡增多, 線粒體內嵴腫脹, 排列不規則, 有溶解現象; 內質網擴張, 空泡增多, 其他細胞器基本無變化.

(a) 對照組中的肌原纖維(×8000); (b) 饑餓組肌原纖維(×15000); (c) 對照組線粒體及內嵴(×12000); (d) 饑餓組線粒體(×12000); (e) 對照組細胞核及核膜(×8000); (f) 饑餓組細胞核及核膜(×8000); (g) 對照組核糖體(×6000); (h) 饑餓組核糖體(×6000). My: 肌原纖維; M: 線粒體; Cr: 線粒體內嵴; NM: 細胞核核膜; N: 細胞核; R: 核糖體.

如圖4所示, 對照組中肌原纖維致密, 排列規則, 明暗帶清晰; 線粒體豐富, 為橢圓形, 內嵴發達, 分布均勻, 間質濃密; 細胞核規則, 核膜完整. 肌肉細胞在16d饑餓脅迫后除了細胞核染色質固縮外, 其他細胞器無明顯的變化.

(a) 對照組肌原纖維(×10000); (b) 饑餓組肌原纖維(×10000); (c) 對照組線粒體(×7500); (d) 饑餓組線粒體(×12000); (e) 對照組細胞核及核膜(×15000); (f) 饑餓組細胞核及核膜(×8000). My: 肌原纖維; M: 線粒體; NM: 細胞核核膜; N: 細胞核.

3 討論

3.1 饑餓脅迫下日本抗氧化酶的反應

學者前期研究表明抗氧化酶與生物機體的健康狀況、免疫保護、環境應激等因素有關, 與生物抵抗環境脅迫密切相關, 既可以用來指示生物機體的非特異性免疫能力, 也可以用來作為環境脅迫檢測的重要指標之一[10-11]. 水生生物在受到饑餓或其他環境因素脅迫時, 大量活性氧就會在細胞內累積, 活性氧在對抗外界脅迫的同時也會對細胞造成一定的傷害. 包括SOD、CAT在內的抗氧化酶體系可以降低自由基反應. SOD可以催化生物體內超氧陰離子(O2ˉ), 使之發生歧化反應生成過氧化氫(H2O2)和分子氧(O2), CAT能還原H2O2轉化為水和氧, 兩者聯合作用在動態平衡中抵御自由基的損傷[12-14]. 由此可見, SOD和CAT在應對環境脅迫時起主導作用, 通過酶活性來調節代謝水平、能量分配和能源物質消耗以維持機體的正常生理活動[8].

本試驗也證明饑餓脅迫下日本蟳4種組織中SOD和CAT參與了機體的生理調節, 而且不同組織中兩種酶反應規律有所不同, 體現出細胞受到饑餓脅迫的破壞程度不同. 鰓的反應最快, 第4d兩種酶就出現了較大的刺激和抑制效應, 肝胰腺中SOD在第12d才表現出強烈的刺激效應. 試驗結束時鰓和肝胰腺中兩種酶都沒有恢復到對照組水平, 說明是饑餓脅迫的重要靶器官. 原因可能是鰓具有呼吸、排泄、調節滲透壓等多種功能, 肝胰腺則是日本蟳營養消化吸收的場所, 對營養和能量的需求非常高, 所以對饑餓脅迫比較敏感[15]. 而心臟和肌肉不具有吸收和代謝功能, 所以兩種酶變化程度不大.

此外, 同一組織中SOD和CAT活性受脅迫時的反應并不同步, 或許存在互補作用, 這和許星鴻等[16]的研究結果一致. 一方面是因為SOD和CAT是一個動態的保護系統, 兩種酶互相配合, 共同抵御外界的侵害. 例如肝胰腺CAT活力降低的時候, SOD活力卻顯著升高. 另外一方面也可能是因為不同組織承擔的生理功能不同, 饑餓脅迫所攻擊的靶細胞不同.

3.2 饑餓脅迫對日本細胞超微結構的影響

細胞結構是動物生理功能的單位, 結構的損傷必將導致功能的變化, 功能異常又可能加速結構的損傷. 試驗表明16d饑餓脅迫下日本蟳鰓細胞、肝胰腺細胞和心臟細胞的細胞器超微結構有不同的變化; 肌肉細胞和對照組比較除了細胞核染色質固縮外基本無變化; 心臟細胞中線粒體和肌原纖維是脅迫的主要靶部位, 其他細胞器基本無變化.

4 結論

日本蟳具有一定的抵御饑餓脅迫的能力, 但這種能力是有限的. 組織細胞酶活性的大小是環境脅迫作用和保護酶系統自身防御共同作用的結果[22]. 在饑餓脅迫下的日本蟳可以通過調節抗氧化酶的水平來增強其清除活性氧的能力, 從而減輕外界脅迫的傷害, 但脅迫加強會導致日本蟳細胞代謝失調和細胞結構的破壞. 傳統水產養殖主要依靠抗生素和化學藥物進行病害防治, 不僅會污染水環境, 還會通過食物鏈影響人類健康. 可以考慮通過短期饑餓脅迫以及在餌料中添加小球藻等方法來激發日本蟳的抗氧化能力, 減少病蟲害的大規模發生[23-24].

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Effects of starvation stress on the activities of antioxidant enzymes and cell ultrastructure of

DING Aixia

( School of Civil and Environmental Engineering, Ningbo University, Ningbo 315211, China )

Using the transmission electron microscopy and spectrophotometry, the current study was designed to investigate the effect of the starvation stress on the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and the ultrastructure of 4 tissues (gill, hepatopancreas, heart and muscle) in. The results indicated that SOD and CAT activities inexhibited high tissue specificity. The order of SOD activity distributed in different tissues from high to low was heart, gill, muscle and hepatopancreas. The order of CAT activity was hepatopancreas, heart, gill and muscle. SOD and CAT activities have been changed , following the introduction of the starvation stress. SOD holistically showed a significant stimulating effect within 16 days. CAT in gill was alleviated and CAT in hepatopancreas showed initial decrease and subsequent increase. The ultrastructure of four tissue cells were significantly altered under the starvation stress. Swelling gill filament, thinning cuticle and partially dissolved mitochondria was evident in Gill cells. Decreased microvilli, mitochondrion partly disintegrated, expanded endoplasmic reticulum and a few irregular nuclei was found in hepatopancreas cells. Mitochondria in heart cells was partially dissolved and myofibrils were swelled. Chromatin of muscle cells were pagans. It is concluded thatitself has limited defense ability against starvation stress.

; starvation; antioxidant enzyme; ultrastructure

2022?03?04.

寧波大學學報（理工版）網址: http://journallg.nbu.edu.cn/

丁愛俠（1974－）, 女, 江蘇連云港人, 高級實驗師, 主要研究方向: 海洋環境生態. Email: dingaixia@nbu.edu.cn

S917

A

1001-5132（2022）04-0001-08

（責任編輯 韓 超）