基于電子鼻技術(shù)對(duì)草莓采后灰霉病的分析與早期診斷

劉 強(qiáng)，張婷婷，周丹丹，丁海臻，張 斌，陳 敏，丁 超，潘磊慶，屠 康,*

（1.南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2.南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，江蘇 南京 210037；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

草莓果實(shí)色澤鮮艷，香氣馥郁，富含多種維生素、糖類、有機(jī)酸等物質(zhì)，以及花色苷類、黃酮類等多種天然抗氧化活性物質(zhì)，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用價(jià)值，深受廣大消費(fèi)者的青睞。草莓果實(shí)屬于漿果類水果，其果肉易在傳送運(yùn)輸過(guò)程中受到機(jī)械損傷和微生物侵染變質(zhì)，致使呈現(xiàn)腐爛、斑點(diǎn)等，導(dǎo)致果實(shí)風(fēng)味消失，口感下降。其中灰霉病是草莓采后運(yùn)輸和貯藏中最容易發(fā)生的病害，可以發(fā)生在采摘、運(yùn)輸、貯藏以及貨架銷售等任何環(huán)節(jié)。侵染初期在果實(shí)表面出現(xiàn)水浸狀、針眼大的斑點(diǎn)，而后逐漸擴(kuò)大形成不規(guī)則形狀的病斑，直至表面出現(xiàn)大量菌絲體及孢子。灰霉病具有繁殖周期短、寄生范圍廣、遺傳變異快的特點(diǎn)，一般可造成減產(chǎn)10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可高達(dá)50%以上，短期3～5 d即可完成對(duì)整果的侵染。通常，草莓除鮮食外，大部分加工方式仍以初級(jí)加工為主，安全性和高值化的產(chǎn)品成為消費(fèi)市場(chǎng)的發(fā)展趨勢(shì)。在草莓果實(shí)采摘和貯運(yùn)過(guò)程中，極容易遭受機(jī)械碰撞、擠壓產(chǎn)生瘀傷，但此時(shí)果實(shí)仍具有一定程度的消費(fèi)價(jià)值，可以用于果醬、果汁等加工行業(yè)的應(yīng)用。然而，當(dāng)果實(shí)遭受病害微生物侵染后，不僅消費(fèi)價(jià)值顯著降低，食用的安全性也受到嚴(yán)重影響，需要被嚴(yán)格區(qū)分。另一方面，當(dāng)病害果實(shí)未被及時(shí)檢測(cè)和剔除，極容易在短期內(nèi)造成整批次果實(shí)的交叉感染，產(chǎn)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。因此，做好草莓采后真菌病害檢測(cè)可以為草莓產(chǎn)業(yè)高值化發(fā)展提供重要支持。

草莓果實(shí)在運(yùn)輸和貯藏中受到病害侵染使水果新陳代謝紊亂，其正常的生理機(jī)能和組織會(huì)發(fā)生一系列的變化。以灰葡萄孢霉（）為典型的采后草莓致病菌能在運(yùn)輸、貯藏和銷售所有環(huán)節(jié)侵染果實(shí)，條件合適時(shí)，短期4 d左右即能引起整果完全腐爛。此外，病害果實(shí)若不及時(shí)剔除，極容易造成整批次果實(shí)的腐爛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值急劇下降。傳統(tǒng)的水果病蟲(chóng)害的檢測(cè)方法有人工分揀、理化指標(biāo)檢測(cè)。人工分揀存在工作單調(diào)、主觀性強(qiáng)、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)；傳統(tǒng)理化檢測(cè)具有破壞性，存在檢測(cè)樣品時(shí)間長(zhǎng)、預(yù)處理繁瑣、周期長(zhǎng)等問(wèn)題。若能在無(wú)損、非接觸等條件下實(shí)現(xiàn)果實(shí)采后病害的診斷，將有利于推動(dòng)草莓產(chǎn)業(yè)分類分級(jí)等精細(xì)化發(fā)展。

電子鼻作為一種仿生嗅覺(jué)技術(shù)，內(nèi)部的陣列傳感器可以捕捉樣本的揮發(fā)性化學(xué)成分的信息，并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)用以描述樣品的特征氣味。Sanefiar等指出食物貯藏過(guò)程中，腐敗氣味主要來(lái)源于微生物的代謝，而這種氣味變化可以被電子鼻系統(tǒng)捕捉并進(jìn)行差異分析；Pan Leiqing等研究表明草莓果實(shí)在不同真菌病害過(guò)程中的電子鼻信號(hào)會(huì)呈現(xiàn)差異，而這種差異能否用于后期的定量分析需進(jìn)一步驗(yàn)證；Pallottino等對(duì)柑橘青霉病無(wú)損檢測(cè)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合電子鼻技術(shù)和化學(xué)計(jì)量學(xué)建立的病害識(shí)別模型，可對(duì)2%～5%霉變率的整批次柑橘實(shí)現(xiàn)無(wú)損檢測(cè)；此外，根據(jù)果實(shí)自身的氣味特性，相關(guān)研究也證實(shí)了電子鼻在水果成熟度、硬度、糖含量和pH值含量方面進(jìn)行預(yù)測(cè)。然而，以上研究主要開(kāi)展電子鼻技術(shù)在水果品質(zhì)和微生物污染程度檢測(cè)方面的可行性分析，特征數(shù)據(jù)處理方式較單一，對(duì)草莓病害過(guò)程的傳感器信號(hào)與氣味組分間的內(nèi)在聯(lián)系仍需進(jìn)一步研究。

因此，為了明確電子鼻對(duì)草莓采后灰霉病的檢測(cè)可行性與精度，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)草莓果實(shí)病害過(guò)程中揮發(fā)性化學(xué)成分的差異、微生物攜帶總量以及氣味傳感陣列信息之間的關(guān)聯(lián)性，采用電子鼻技術(shù)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)果實(shí)真菌污染過(guò)程進(jìn)行評(píng)價(jià)，建立基于電子鼻系統(tǒng)的采后早期病害識(shí)別分類模型，以期為實(shí)現(xiàn)草莓采后真菌病害無(wú)損檢測(cè)和在線監(jiān)控技術(shù)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草莓果實(shí)（品種：‘紅顏’）采摘于江蘇省南京市鎖石生態(tài)園（北緯32°07’?東經(jīng)118°59’），采摘時(shí)間為2019年2月27日和2019年3月20日?植株生長(zhǎng)于生態(tài)園中溫室大棚，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，約花期后40 d采摘。由專業(yè)農(nóng)戶采摘大小一致，表觀沒(méi)有機(jī)械損傷、無(wú)病害的草莓果實(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)樣本，并在采摘后1 h內(nèi)立即輸送至實(shí)驗(yàn)室，流程如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig. 1 Flow char of the experiment

氯化鈉（分析純） 西隴科學(xué)股份有限公司；2-辛酮（色譜級(jí)） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；孟加拉紅培養(yǎng)基、馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基 上海盛思生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PEN3電子鼻系統(tǒng) 德國(guó)AIRSENSE公司；7890A氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司；PDMS/DVB/CAR萃取頭 美國(guó)Supelco公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；HH-1恒溫水浴鍋、ZD-85A振蕩搖床 常州國(guó)華電器有限公司；ME-T分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；PCTHI-150T恒溫恒濕箱 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理

為避免未知真菌病害造成草莓果實(shí)腐爛，采用0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡1 min；隨后自來(lái)水浸泡2 次，每次1 min；并最后采用流動(dòng)滅菌蒸餾水沖洗1 次，消除果實(shí)表面殘余的次氯酸鈉，洗凈后的果實(shí)在室溫條件下（20±5）℃自然晾干。選取典型草莓采后病害真菌灰葡萄孢霉作為致病真菌。菌株在恒溫恒濕培養(yǎng)箱（溫度（28±1）℃，相對(duì)濕度（85±10）%）條件下活化2 周，制備孢子懸浮液，調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度至1×10spores/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

處理組樣本表面采用穿刺法接種，采用滅菌槍頭在果實(shí)表面中心位置注射20 μL的孢子懸浮液，注射深度為果實(shí)皮下2 mm。接種完成后，所有樣本自然晾干消除表面殘余水分，并轉(zhuǎn)移至消毒過(guò)的恒溫恒濕箱內(nèi)貯藏，此時(shí)設(shè)為采后貯藏初始時(shí)間點(diǎn)，貯藏條件設(shè)為溫度（20±1）℃和相對(duì)濕度（85±5）%用以模擬常溫貨架條件；除接種孢子懸浮液替換成接種無(wú)菌生理鹽水外，對(duì)照組所有樣本處理與處理組一致。為獲取不同病害階段的草莓果實(shí)，取樣時(shí)間分別設(shè)置0、24、48、72、96、120 h，待測(cè)樣本在獲取電子鼻信號(hào)后，用于理化指標(biāo)及微生物攜帶量的測(cè)定。

早期病害定義參照文獻(xiàn)[2]，并補(bǔ)充條件：菌斑面積低于5%，未出現(xiàn)菌絲或其他繁殖體，無(wú)組織液外滲；病害自接種后貯藏時(shí)間不超過(guò)48 h。

1.3.2 電子鼻系統(tǒng)

采用商業(yè)化便攜式電子鼻檢測(cè)系統(tǒng)。設(shè)備主要由進(jìn)氣單元、傳感器陣列和模式識(shí)別系統(tǒng)組成。空氣流通采集電子鼻信號(hào)之前，將樣品放置250 mL玻璃燒杯中，用錫箔紙密封燒杯端口。置于25 ℃水浴條件下，平衡10 min用以消除傳感器檢測(cè)時(shí)的基線漂移。采用頂空采樣法進(jìn)行樣品氣味收集，檢測(cè)時(shí)間設(shè)為60 s，記錄點(diǎn)默認(rèn)每隔1 s，進(jìn)氣速率設(shè)為0.15 L/min。傳感器響應(yīng)信號(hào)值以電導(dǎo)率/值表示，完成單個(gè)樣本測(cè)量后，進(jìn)行120 s的自然洗氣，基線歸零時(shí)間設(shè)為5 s，歸零后/值強(qiáng)制初始化為1。對(duì)所有樣本進(jìn)行電子鼻信號(hào)采集，重復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 次，取平均值用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.3.3 揮發(fā)性化學(xué)成分檢測(cè)

草莓果實(shí)揮發(fā)性化學(xué)成分采用頂空固相微萃取（headspace solid phase micro-extraction，HP-SPME）模式，結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行氣味成分的定性與定量分析。測(cè)定方法及參數(shù)設(shè)定參照文獻(xiàn)[8]并修改。

HP-SPME程序：鮮樣草莓液氮研磨后，分別稱取（5.0±0.3）g樣品粉末、1 g NaCl置于20 mL頂空瓶中，內(nèi)標(biāo)加入100 μL質(zhì)量濃度5.24 μg/mL的2-辛酮溶液，密封后混勻。采用活化后PDMS/DVB/CAR纖維萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，60 ℃水浴條件下，固相微萃取50 min。

GC-MS程序：采用7890 GC-MS儀。程序初始溫度40 ℃，保持5 min后，以5 ℃/min速率升至150 ℃；再以10 ℃/min速率升溫至240 ℃，最后保持5 min。采用氦氣（純度＞99.99%）作為載氣，流速1.00 mL/min；離子源溫度230 ℃；離子阱溫度150 ℃；傳輸線溫度默認(rèn)170 ℃；質(zhì)量掃描范圍/30～450；發(fā)射電流25 μA；掃描時(shí)間0.6 s；萃取解吸溫度250 ℃，手動(dòng)進(jìn)樣解吸時(shí)間5 min。各揮發(fā)性化學(xué)成分檢測(cè)定性結(jié)果與NIST11.0質(zhì)譜庫(kù)比對(duì)，保留匹配度80%以上的物質(zhì)。平行實(shí)驗(yàn)設(shè)置為3 次，重復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 次，取平均值用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 微生物含量檢測(cè)

測(cè)定方法參考GB 4789.15—2016《食品微生物含量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)》。切取接種病害部位草莓（15±0.5）g，研磨后溶解于135 mL無(wú)菌生理鹽水，180 r/min條件下振蕩2 min。隨后梯度稀釋至目標(biāo)濃度。采用滅菌移液槍頭吸取1 mL的目標(biāo)溶液，并倒入孟加拉紅培養(yǎng)基，待冷卻后倒置。冷卻后的平板放置于27 ℃、相對(duì)濕度85%的恒溫恒濕箱中培養(yǎng)2～3 d，對(duì)霉菌菌落計(jì)數(shù)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以lg（CFU/g）表示。重復(fù)實(shí)驗(yàn)設(shè)為3 次，取平均值用于數(shù)據(jù)分析。

1.3.5 特征數(shù)據(jù)提取

本實(shí)驗(yàn)中電子鼻系統(tǒng)可采集單個(gè)樣本60 s時(shí)間內(nèi)10個(gè)傳感器的響應(yīng)變化值，每個(gè)傳感器對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲線包含初始化階段、快速響應(yīng)階段和穩(wěn)定化階段。根據(jù)草莓果實(shí)信號(hào)變化規(guī)律，采用3種不同特征數(shù)據(jù)提取方案：快速響應(yīng)值（第10秒）；穩(wěn)定響應(yīng)值（第60秒）；感應(yīng)曲線最大斜率值，分別構(gòu)建不同預(yù)測(cè)模型。

1.3.6 主成分分析（principal component analysis，PCA）

由于電子鼻的傳感器信息中包含多重共線和非結(jié)構(gòu)化問(wèn)題，即使在經(jīng)過(guò)特征提取后，每個(gè)樣本仍包含10個(gè)傳感器得到的特征數(shù)據(jù)（即維度為10）。結(jié)合PCA處理，通過(guò)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行新矩陣投影降維，將原有存在相互關(guān)聯(lián)性的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成相同維度但互不相關(guān)的單獨(dú)成分。這些PC按照貢獻(xiàn)率從大到小排列，除排名靠前的少數(shù)幾個(gè)PC，其余后續(xù)PC貢獻(xiàn)率較低，對(duì)整個(gè)信息的描述可以忽略。

1.3.7 數(shù)據(jù)建模

涉及構(gòu)建基于電子鼻傳感器信號(hào)的草莓真菌病害階段分類及定量預(yù)測(cè)分析方法，采用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）和偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLSDA）進(jìn)行模型構(gòu)建。

1.3.8 數(shù)據(jù)集劃分

研究共涉及到2 批次草莓采后真菌病害實(shí)驗(yàn)無(wú)損建模：草莓果實(shí)病害微生物攜帶量的無(wú)損預(yù)測(cè)分析（建模實(shí)驗(yàn)1）、草莓果實(shí)早期病害的預(yù)測(cè)分類（建模實(shí)驗(yàn)2）。建模實(shí)驗(yàn)1中，根據(jù)6個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)，設(shè)置每組15個(gè)樣品（合計(jì)：6個(gè)取樣點(diǎn)×15個(gè)樣本=90個(gè)樣本），在采集完電子鼻信號(hào)后，進(jìn)行微生物平板計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)量按照2∶1劃分建模集（60個(gè)樣本）和驗(yàn)證集（30個(gè)樣本），劃分依據(jù)參照Kennard-Stone算法挑選。

早期病害預(yù)測(cè)分類實(shí)驗(yàn)中，采用外部驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分類模型建立，設(shè)定雙批次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行模型驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)共計(jì)收集126個(gè)健康果實(shí)和126個(gè)早期病害果實(shí)電子鼻信息數(shù)據(jù)。按照2∶1劃分建模集（168個(gè)樣本）與驗(yàn)證集（84個(gè)樣本）。

1.3.9 模型評(píng)價(jià)

采用決定系數(shù)（）、校正均方根誤差（root mean squared error of calibration，RMSEC）、交互驗(yàn)證均方根誤差（root mean square cross validation，RMSECV）、預(yù)測(cè)均方根誤差（root mean square error of prediction，RMSEP）、相對(duì)預(yù)測(cè)偏差（prediction of relative deviation，RPD）進(jìn)行模型精度評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析對(duì)不同貯藏時(shí)間點(diǎn)的微生物攜帶量、揮發(fā)性成分進(jìn)行差異顯著分析（＜0.05，差異顯著；＜0.01，差異極顯著）；預(yù)測(cè)模型和分類模型建立均采用Matlab軟件PLS_toolbox 7.5工具箱；PCA采用SPSS 18.0版軟件進(jìn)行；所有圖形繪制采用Origin 9.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物含量變化

草莓采后病害時(shí)，微生物攜帶量和表觀形態(tài)發(fā)生與病害時(shí)間呈現(xiàn)規(guī)律性變化，如圖2所示。在接種病菌后分別貯藏24、48、72、96、120 h，草莓果實(shí)真菌含量分別從初始1.65（lg（CFU/g））上升至2.61、2.86、3.86、4.53、5.00（lg（CFU/g））。初始0～48 h階段微生物總量增加了1.21（lg（CFU/g）），而在隨后的48 h貯藏時(shí)間內(nèi)（48～96 h），微生物含量增幅擴(kuò)大成2.98（lg（CFU/g））。這種上升趨勢(shì)在96～120 h貯藏時(shí)間段開(kāi)始降低，僅為0.47（lg（CFU/g））。病害草莓發(fā)病48 h后，雖然微生物含量呈現(xiàn)顯著差異，僅從外觀變化難以準(zhǔn)確判斷病害，因此后續(xù)研究嘗試從氣味的角度分析早期病害的可行性。

圖2 貯藏過(guò)程中草莓微生物含量變化和外觀形態(tài)變化Fig. 2 Changes in microbial load and appearance of strawberries during storage

2.2 揮發(fā)性成分變化

草莓病害過(guò)程會(huì)發(fā)生明顯氣味成分變化，采用SPME-GC-MS技術(shù)對(duì)病害過(guò)程進(jìn)行全掃描分析，并添加100 μL內(nèi)標(biāo)物（5.24 μg/mL 2-辛酮）用于半定量分析。如表1所示，主要揮發(fā)性化學(xué)成分包括醇類4種、醛類6種、酸類6種、酯類10種、酮類3種、萜烯類2種以及其他類3種，不同發(fā)病時(shí)期對(duì)應(yīng)的物質(zhì)種類以及含量均不相同。4-羥基-2,5-二甲基-3(2)呋喃酮（4-hydroxy-2,5-dimethyl-3(2)-furanone，HDMF）和4-甲氧基-2,5-二甲基-3(2)呋喃酮（4-methoxy-2,5-dimethyl-3(2)-furanone，DMMF）是形成草莓特有香氣的關(guān)鍵物質(zhì)成分，HDMF與丁酸乙酯的混合可以呈現(xiàn)“草莓味”香氣。本實(shí)驗(yàn)HDMF和DMMF含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，其中在病害72 h后果實(shí)DMMF含量可顯著增至0.36 μg/g；當(dāng)病害發(fā)生120 h時(shí)，含量低于0.01 μg/g。病害發(fā)生初始時(shí)，會(huì)促進(jìn)果實(shí)的成熟和水果香味的散發(fā)；而當(dāng)對(duì)應(yīng)的特征香氣成分急速下降后，表明草莓果實(shí)已經(jīng)嚴(yán)重或完全腐爛，喪失了商品價(jià)值。

表1 草莓果實(shí)病害過(guò)程中主要的揮發(fā)性物質(zhì)及其含量Table 1 Contents of major volatile compounds in strawberry samples during storage μg/g

健康果實(shí)中，除HDMF和DMMF外，如橙花叔醇、芳樟醇、正己醛、乙酸乙酯等物質(zhì)均為草莓的主要揮發(fā)性成分。此外，成熟草莓揮發(fā)性成分中乙醇、芳樟醇、橙花叔醇、2-己烯醛、正己醛、己酸乙酯、乙酸甲酯、HDMF和DMMF均被檢出，對(duì)應(yīng)的醛類和酯類的種類最多。病害草莓中，揮發(fā)性酯類由初始的4種物質(zhì)被檢出，在72 h后上升到8種；而后持續(xù)下降，在120 h后僅有2種酯類物質(zhì)被檢出。橫向比較不同病害時(shí)間發(fā)現(xiàn)，病害發(fā)生24 h時(shí)，青草類香氣成分如2-己烯醛會(huì)顯著下降（＜0.05），由0.62 μg/g降至0.38 μg/g，反映了草莓果實(shí)的進(jìn)一步成熟和衰老，類似結(jié)果也出現(xiàn)在桃果實(shí)采后病害的分析中。當(dāng)果實(shí)受到外界脅迫后，通過(guò)激活相關(guān)酶代謝途徑合成相關(guān)C或C類醇、醛類物質(zhì)增強(qiáng)自身防御體系。但隨著病原微生物的破壞力進(jìn)一步增強(qiáng)，草莓原有的果實(shí)香氣成分逐漸喪失，乙醇含量急劇上升，從0.72 μg/g（72 h）上升至3.95 μg/g（120 h）。

圖3 草莓病害過(guò)程中揮發(fā)性物質(zhì)的定量分析Fig. 3 Changes in contents of different classes of volatile compounds in strawberries during fungal decay

如圖3所示，不同病害時(shí)間下，草莓揮發(fā)性氣味中的醇類、醛類、酯類、酸類、萜烯類以及其他成分總量及占比不同。酯類含量由初始的0.37 μg/g（0 h）上升至2.14 μg/g（72 h），然后急劇下降至0.24 μg/g（120 h）。病害推動(dòng)了糖類、脂類及蛋白質(zhì)等化合物的分解進(jìn)程，加速了草莓果實(shí)的成熟和衰老。初始階段時(shí)，果實(shí)抵抗能力較強(qiáng)，自身呼吸作用加強(qiáng)，酯類物質(zhì)增多；隨病害加劇，果實(shí)自身合成酯類物質(zhì)的代謝體系被完全破壞，揮發(fā)性成分呈現(xiàn)急劇下降。醇類作為真菌病害過(guò)程的最典型物質(zhì)，在整個(gè)過(guò)程中含量由初始的0.85 μg/g上升至3.95 μg/g；而對(duì)應(yīng)的醛類含量從1.15 μg/g下降至0.06 μg/g，這種與病害過(guò)程的特殊關(guān)聯(lián)性，已被用于特定的草莓腐爛指數(shù)數(shù)學(xué)模型建立。

2.3 傳感器響應(yīng)特性

圖4 不同特征提取模式下電子鼻信號(hào)變化差異Fig. 4 Variation in electronic nose signals in different feature extraction modes

由圖4可知，在快速響應(yīng)時(shí)間時(shí)，No.2對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值普遍偏低，范圍在1.43～5.75之間（圖4a）；分析所有傳感器響應(yīng)曲線最大斜率發(fā)現(xiàn)，整個(gè)過(guò)程中No.7和No.9號(hào)傳感器變化波動(dòng)最為劇烈，而No.2傳感器在整個(gè)過(guò)程中呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)（圖4c）。

結(jié)合傳感器對(duì)應(yīng)的敏感化合物分析看，No.2、No.7和No.9響應(yīng)值變化可能是草莓果實(shí)病害過(guò)程中，醇類、酯類和萜烯類揮發(fā)性物質(zhì)含量上升所引起的（圖3），或者其他成分含量（如醛類）在貯藏過(guò)程中發(fā)生明顯的變化所造成。部分傳感器，如No.4和No.10傳感器在整個(gè)階段保持相對(duì)穩(wěn)定，原因是它們敏感物質(zhì)分別對(duì)應(yīng)的氫氣和烷烴，不是草莓果實(shí)主要揮發(fā)性成分（表1）。另一方面，傳感器檢測(cè)限也是影響信號(hào)波動(dòng)的主要原因，如No.2、7和9號(hào)傳感器檢測(cè)限可達(dá)0.001 g/m，對(duì)揮發(fā)性成分的波動(dòng)相對(duì)敏感。

2.4 不同病害階段PCA

不同病害階段的草莓樣本電子鼻信號(hào)PCA結(jié)果如圖5所示。快速響應(yīng)值、穩(wěn)定響應(yīng)值、最大斜率值的PC1貢獻(xiàn)率均超過(guò)80%，說(shuō)明了PCA可對(duì)電子鼻數(shù)據(jù)進(jìn)行大規(guī)模的保留。分析整個(gè)病害過(guò)程，將0～24、48～72 h和96～120 h分別歸為早期階段、中期階段以及后期階段進(jìn)行定性區(qū)分。結(jié)果表明，所有模式下病害發(fā)生的早期階段與后期階段能實(shí)現(xiàn)完全區(qū)分，這說(shuō)明電子鼻數(shù)據(jù)可以用于區(qū)分早期霉變和完全霉變的果實(shí)。另一方面，中期階段與其他兩個(gè)階段仍有部分樣品重疊，尚未無(wú)法完全分離，這是因?yàn)槭芄麑?shí)個(gè)體生理差異，在接種病原菌后發(fā)病程度不完全與貯藏時(shí)間一一對(duì)應(yīng)。

在電子鼻信號(hào)降維基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將降維后的特征數(shù)據(jù)與草莓病害指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)性探討。選取原始數(shù)據(jù)貢獻(xiàn)率最大的PC1作為表征參數(shù)，開(kāi)展不同提取模式下的PC1與病害重要參數(shù)的回歸性分析，結(jié)果如表2所示。3種模式下的PC1與真菌總數(shù)、醇類、其他揮發(fā)性成分呈正相關(guān)，與醛類、酸類、酯類、酮類以及萜烯類揮發(fā)性成分成負(fù)相關(guān)。其中穩(wěn)定響應(yīng)值下對(duì)應(yīng)的PC1與真菌總數(shù)的關(guān)聯(lián)性系數(shù)最高（=0.982）。酸類、酯類、酮類和萜烯類雖然都與PC1有一定的關(guān)聯(lián)性，但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上并不顯著（＞0.05）。這表明單一的PC數(shù)據(jù)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)部分參數(shù)如真菌總量、醇類以及其他類物質(zhì)的相關(guān)分析或預(yù)測(cè)，但針對(duì)病害過(guò)程中總體的特征變化仍有不足。

圖5 草莓病害的電子鼻數(shù)據(jù)PCAFig. 5 PCA loading plot for healthy and diseased strawberries based on E-nose data

表2 草莓病害過(guò)程品質(zhì)指標(biāo)與PC1相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of PC1 values and quality attributes in strawberry fruit during storage

2.5 多特征模式下微生物含量預(yù)測(cè)

表3 基于電子鼻信息的草莓果實(shí)真菌總數(shù)PLSR模型的預(yù)測(cè)結(jié)果Table 3 Performance of the PLSR models for microbial load of individual strawberries based on E-nose data

2.6 病害早期階段的分類

基于電子鼻穩(wěn)定信號(hào)值的健康草莓（class 1）和早期病害草莓（class 2）的PLS-DA模型分類結(jié)果見(jiàn)圖6。對(duì)2 批次共計(jì)252個(gè)草莓樣本電子鼻穩(wěn)定信號(hào)值分析發(fā)現(xiàn)，能夠?qū)崿F(xiàn)健康草莓85.7%（判定正確數(shù)量72個(gè)/總體建模數(shù)量84個(gè)）建模準(zhǔn)確率和69.0%（判定正確數(shù)量29個(gè)/總體建模數(shù)量42個(gè)）的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率；早期病害草莓能夠?qū)崿F(xiàn)92.9%（判定正確數(shù)量78個(gè)/總體建模數(shù)量84個(gè)）建模準(zhǔn)確率和92.9%（判定正確數(shù)量39個(gè)/總體建模數(shù)量42個(gè)）預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率。結(jié)果表明在電子鼻穩(wěn)定信號(hào)的數(shù)據(jù)源基礎(chǔ)上建立的無(wú)損分類模型，基本可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的早期病害判別。PLS-DA算法能基本做到表征出兩者不同類型樣本間的映射關(guān)系，但健康草莓果實(shí)更容易被誤判成早期病害草莓，模型準(zhǔn)確率有待進(jìn)一步提高。原因可能是早期病害引起的氣味差異被果實(shí)自身的香氣掩蓋。后續(xù)研究關(guān)于如何改善草莓早期病害識(shí)別方面需要進(jìn)一步優(yōu)化。

圖6 基于電子鼻穩(wěn)定信號(hào)值的草莓的PLS-DA模型分類結(jié)果Fig. 6 Classification results of strawberries by PLS-DA model based on E-nose stable responses

3 討 論

采用電子鼻技術(shù)捕捉水果/農(nóng)產(chǎn)品貯藏、加工過(guò)程中的氣味變化特性，可用于對(duì)樣品的品質(zhì)參數(shù)及狀態(tài)等評(píng)判。在已有研究中，Rizzolo等證實(shí)了電子鼻可用于描述桃果實(shí)冷藏過(guò)程中的氣味特性變化，結(jié)果表明果實(shí)在貯藏階段內(nèi)揮發(fā)性成分種類及含量會(huì)出現(xiàn)差異性變化，隨后這種成分的變化造成電子鼻信號(hào)出現(xiàn)規(guī)律性波動(dòng)。Guo Zhiming等利用電子鼻結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)實(shí)現(xiàn)了蘋(píng)果青霉病的無(wú)損檢測(cè)，結(jié)果表明基于傳感器信號(hào)的霉變果實(shí)面積預(yù)測(cè)值高達(dá)0.972，RMSEC為1.28，證實(shí)了電子鼻技術(shù)可以用于水果采后腐爛程度的定量評(píng)價(jià)。本實(shí)驗(yàn)采用電子鼻技術(shù)結(jié)合HP-SPME-GC-MS對(duì)草莓霉變過(guò)程中氣味組分及狀態(tài)信號(hào)進(jìn)行了具體分析，研究過(guò)程發(fā)現(xiàn)電子鼻的特征數(shù)據(jù)與特定真菌病害過(guò)程緊密聯(lián)系，草莓果實(shí)在受到病害后，揮發(fā)性醇類、酯類、醛類、酸類、萜烯類以及部分其他成分及含量變化明顯。其中，醇類總量呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，可由0.85 μg/g上升至3.95 μg/g；而對(duì)應(yīng)的醛類物質(zhì)則是下降最為顯著，可從1.15 μg/g下降至0.06 μg/g。回歸性分析表明上述物質(zhì)組分的變化，是引起電子鼻傳感器特征響應(yīng)的重要因素之一，可以在電子鼻數(shù)據(jù)壓縮和特征降維后呈現(xiàn)出來(lái)。此外，根據(jù)草莓不同真菌病害的氣味差異，Pan Leiqing等對(duì)草莓采后早期病害進(jìn)行了分類預(yù)測(cè)，結(jié)果表明草莓在接種灰葡萄孢霉、匍枝根霉以及擴(kuò)展青霉后的傳感器信號(hào)穩(wěn)定值（10 ℃貯藏2 d）呈現(xiàn)差異，這種信號(hào)的差異可以通過(guò)PCA處理實(shí)現(xiàn)微生物病害類型區(qū)分。

4 結(jié) 論

采用電子鼻技術(shù)、頂空固相微萃取、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以及國(guó)標(biāo)的微生物檢驗(yàn)手段，對(duì)不同病害階段的草莓果實(shí)進(jìn)行了氣味評(píng)價(jià)，揭示了揮發(fā)性組分與電子鼻傳感器信號(hào)間的關(guān)聯(lián)響應(yīng)特性。結(jié)論如下：

1）本實(shí)驗(yàn)條件下，草莓采后灰霉病過(guò)程中，主要醇類物質(zhì)含量可從0.85 μg/g上升至3.95 μg/g；主要醛類物質(zhì)可從1.15 μg/g下降至0.06 μg/g。主要揮發(fā)性醇類、醛類以及少數(shù)幾種物質(zhì)與電子鼻特征信號(hào)呈現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)。

2）結(jié)合不同特征提取方案，分別建立了草莓果實(shí)真菌病害的定量PLSR模型。穩(wěn)定響應(yīng)值對(duì)應(yīng)的預(yù)測(cè)效果相對(duì)最佳，RPD能實(shí)現(xiàn)2.270。

3）開(kāi)展了草莓果實(shí)早期病害的無(wú)損識(shí)別，在草莓接種病害發(fā)生不超過(guò)48 h，病斑面積低于5%，未出現(xiàn)菌絲或其他繁殖體的前提下，采用電子鼻技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)早期病害果實(shí)92.9%的準(zhǔn)確區(qū)分。結(jié)果可為控制草莓/水果采后品質(zhì)安全以及電子鼻技術(shù)在食品微生物檢測(cè)方面的應(yīng)用提供參考。