雞STAT家族成員鑒定及生物信息學分析

孟 婕，張明華，楊 晴，張 貝，李可強，張傳生，耿立英，李祥龍

(河北科技師范學院河北省特色動物種質資源挖掘與創新重點實驗室，河北 秦皇島，066004)

STAT(signal transducers and activators of transcription)是一種潛在的細胞質轉錄因子，是細胞因子和生長因子受體信號傳導的下游效應因子[1]。STAT家族在細胞受體相互作用過程中充當載體，保持信號在細胞內傳遞有內在特異性，引導一部分細胞反應，有控制細胞生長、分化、增殖免疫調節等功能[2～4]。研究發現，STAT含有特定的STAT結構域和SH2結構域，SH2作為最保守的STAT結構域通過結合特定磷酸酪氨酸基序的能力在信號傳導中起重要作用[5，6]。

大量研究發現，STAT家族基因在細胞增殖、凋亡、分化和免疫調節等生理過程中的作用復雜且重要，激活后的STAT基因可通過轉錄調控多種原癌基因的表達來誘導腫瘤的發生[7]。STAT1被認為在生長停滯和凋亡中起重要作用，并作為腫瘤抑制因子，而STAT3和STAT5則參與促進細胞周期進展、細胞轉化和防止凋亡[5，8～10]。Cuiping等發現STAT6在肺癌的間質細胞及免疫細胞中高表達，STAT6-/-腫瘤小鼠中CD11b+細胞的動員和分化降低，STAT6的缺乏抑制腫瘤增殖[11]。

隨著雞基因組測序的完成，在基因組水平上研究雞STAT家族的信息成為一種可能。筆者采用生物信息學方法，對STAT基因及其編碼產物的理化性質、序列結構特征、染色體定位和二級結構進行預測和分析。同時，對3個物種進行序列比對，構建系統進化樹，以期為進一步研究STAT家族的功能、揭示雞STAT家族抗病分子機制奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 雞STAT家族成員鑒定與序列特征分析

在Ensemble數據庫(http://asia.ensemble.org/index.htm)，下載雞基因組序列信息和基因組基因結構注釋信息文件。從Pfam蛋白家族數據(http://pfam.xfam.org/)下載STAT蛋白的隱馬可夫模型(PF02865)，并以此作為查詢搜索雞可能STAT蛋白序列，進一步在Batch CD-Search (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb.cgi)和SMART (http://smart.emble-heidellerg.de/)對其進行驗證分析，剔除不含STAT結構域、SH2結構域、其他結構域及注釋不完整的序列，最終獲得雞STAT基因家族成員。利用在線工具ExPASy[12](http://web.expasy.org/protparam/)預測雞STAT家族成員理化性質(等電點、蛋白分子量和氨基酸數量等屬性)。

1.2 雞STAT家族系統進化樹的構建

從NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載人和家鼠的STAT蛋白序列，將它與雞STAT蛋白序列整合。通過MEGA-X[13]中的ClustalW將人、家鼠和雞STAT蛋白序列進行多序列比對分析。并通過鄰接法(Neighblour-Joining，NJ)構建系統進化樹，自展值(Bootstrap)設定為1 000。

1.3 雞STAT家族成員motif及基因結構分析

使用在線網站 MEME( http://meme-suiteorg/tools/meme) 對STAT蛋白序列的保守基序進行預測分析，搜索motif值設定為10。STAT的外顯子和內含子位置信息參考雞基因組注釋信息gff3文件，利用TBtools[14]軟件對其可視化分析。

1.4 雞STAT的染色體定位

利用TBtools軟件從基因組結構注釋文件(gff3)中獲得雞STAT染色體位置信息，并通過其Gene Location Visualize from GTF/GFF功能制作染色體定位圖。

1.5 STAT家族蛋白質二級結構預測

利用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對雞STAT蛋白序列的二級結構進行分析，并對STAT家族各成員的二級結構類型在各成員中的占比和分布進行統計。

2 結果與分析

2.1 雞STAT家族成員的鑒定及理化性質

用生物信息學方法并對其進行篩選驗證，從雞全基因組中得到5條STAT基因序列。將5條雞STAT家族基因序列命名為ChSTAT1，ChSTAT2，ChSTAT3，ChSTAT4，ChSTAT5A。對雞STAT家族進行蛋白理化性質分析結果表明，雞STAT家族的氨基酸序列長度最長為905 aa，最短的為749 aa(表1)。家族成員蛋白分子量最大的是99 826.43 ku，最小的是85 695.54 ku。從理論等位點來看，ChSTAT1，ChSTAT2，ChSTAT3，ChSTAT4，ChSTAT5A的等電點均小于7，為酸性蛋白。其中，ChSTAT2等電點最小，為5.39。ChSTAT家族成員不穩定系數大于40，鑒定其為不穩定蛋白。ChSTAT1，ChSTAT2，ChSTAT3，ChSTAT4，ChSTAT5A疏水性都小于0，都是親水蛋白。

表1 雞STAT基因家族基本信息

2.2 不同動物STAT蛋白進化分析

系統進化分析結果表明，雞的5個STAT基因可分為5組(圖1)。5個成員與家鼠和人的STAT家族成員分別聚集，說明STAT基因家族各成員相對較保守。STAT1和STAT4聚為一支，說明相較其他成員STAT1和STAT4親緣關系更近。

注：ChSTAT表示雞，HomoSTAT表示人，MusSTAT表示家鼠。遺傳距離標尺在左下角。 節點上的值為通過Bootstrap檢驗次數的百分數。圖1 雞、家鼠、人STAT家族系統進化樹

2.3 雞STAT家族成員結構特征分析

利用TBtools工具繪制了雞STAT家族成員的結構特征圖。對雞STAT家族的5個成員進行了蛋白保守結構域分析，共獲取了10個motif元件(圖2)。不同STAT保守基元數量從4～10不等且分布不同，但同一分支基因所含保守基序個數及順序較為一致。其中STAT5A的編碼序列較其他成員簡單。基因成員均含有內含子和外顯子。在同一分支的成員，基因結構較相似。

2.4 雞STAT的染色體定位

從雞基因組中提取雞染色體長度、STAT基因在染色體上的位置等信息。結果顯示，ChSTAT定位在3條染色體上(圖3)。ChSTAT1和ChSTAT4定位在7號染色體；ChSTAT3和ChSTAT5A定位在27號染色體；ChSTAT2定位在33號染色體。

圖2 雞STAT家族成員結構特征

圖3 雞STAT基因的染色體分布

表2 雞STAT家族蛋白質二級預測 %

2.5 雞STAT家族蛋白質二級結構預測分析

用SOPMA對雞STAT家族成員蛋白序列的二級結構進行預測，結果表明，雞STAT家族成員全部包含α-螺旋、β-轉角、延伸鏈及無規則卷曲，但各部分所占比例不同(表2)。ChSTAT2主要由無規則卷曲組成，其余4個成員主要由α-螺旋組成，β-轉角在各成員中所占比例最少。

3 結論與討論

STAT家族成員歸屬于一個重要的信號轉導家族，在各種動物中都存在。STAT家族成員在小鼠及人中被研究較多[15，16]。不同的STAT基因之間通過相互作用共同參與免疫調節過程，對于維持機體免疫系統平衡來說，當某個STAT基因的表達失調時就可能導致疾病發生。

本次研究通過隱馬可夫模型對雞基因組中STAT家族的搜索分析，鑒定獲得5個成員。從理論等位點來看，ChSTAT1，ChSTAT2，ChSTAT3，ChSTAT4，ChSTAT5A的等電點均小于7，為酸性蛋白。ChSTAT家族不穩定系數均大于40，鑒定其為不穩定蛋白。ChSTAT1，ChSTAT2，ChSTAT3，ChSTAT4，ChSTAT5A疏水性都小于零，都是親水蛋白。以上分析推測雞STAT基因家族成員較易發生改變。研究發現，STAT2，STAT4和STAT6負責調節免疫應答，而STAT1，STAT3和STAT5(STAT5a和STAT5b)作用不同，它們可以調控細胞周期、細胞存活和血管生成等線管基因的表達，這些基因失調都會導致其活性增加，誘導疾病的發生[17～19]。

基因結構是研究基因進化和基因功能的重要依據。據STAT家族結構特征分析可知，不同STAT保守基序數量從4～10不等，并且保守基序分布也是有所不同的，整體來說，亞家族STAT1～4保守基序分布有些許相似。STAT5A的編碼序列相比較其他亞家族簡單。經過系統進化分析可知，5個成員與家鼠和人的STAT家族成員分別聚集，表明基因保守性較強。相比之下，家鼠和人屬于同一分支再與雞相同基因聚集，說明物種間的差異較大。染色體定位顯示ChSTAT1和ChSTAT4定位在7號染色體；ChSTAT3和ChSTAT5A定位在27號染色體；ChSTAT2定位在33號染色體。結合基因結構分析發現，在同一條染色體上的基因結構整體較為相似。

預測分析蛋白質的結構對雞STAT家族的生物學研究是非常重要的。因為蛋白質只有折疊成特定的空間結構才具有響應的活性和生物學功能[20]。經研究發現，變性蛋白質在可以重新折疊的實驗條件下可以重新折疊到原來的結構[21]。在生物體內蛋白質分子的多肽鏈一般都不是松散的線性分子，而是以α-螺旋、β-折疊延伸鏈、β-轉角和無規則卷曲的形態出現[22]。本次研究發現，雞大多數STAT基因主要由α-螺旋組成，其次是無規則卷曲，占比例最少的是β-折疊。

本次研究鑒定得到5個雞STAT基因家族成員。理化性質分析發現，ChSTAT均為酸性蛋白、不穩定蛋白且是親水蛋白；根據進化關系可知同一分支的基因結構以及蛋白保守結構域較為相近；ChSTAT分布在7，27，33等3條染色體上；除ChSTAT2以外其他成員主要由α-螺旋組成。