布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構(gòu)建及免疫效果分析

周詩淼，于秀劍，冀夢瑤，肖麗榮，張志強，史秋梅，吳同壘

(河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點試驗室，河北 秦皇島，066600)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病，給牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，同時嚴重威脅人類健康[1～3]。疫苗免疫是預(yù)防布魯氏菌病較為有效的方法，商品化的布魯氏菌疫苗有A19，S2，Rev1，M5和RB51等，均為弱毒疫苗，但是存在安全性不足的缺點。例如，A19可導(dǎo)致懷孕動物流產(chǎn)，并存在排毒風(fēng)險，且大都能夠感染人并引起一過性疾病[4～6]。DNA 疫苗安全性高，且現(xiàn)有研究顯示某些基因能夠刺激機體產(chǎn)生較強的保護力，逐漸得到人們的重視[7]。

有研究顯示，基于布魯氏菌L7/L12基因的DNA疫苗能夠產(chǎn)生良好的保護作用[6,8]。GroES是熱休克蛋白hsp60家族的輔助蛋白，可以激活宿主免疫反應(yīng)，同時參與抗原呈遞，增強宿主免疫應(yīng)答水平[9]。筆者期望通過構(gòu)建L7/L12和GroES雙基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染293T細胞，驗證其表達，并免疫小鼠，評價其免疫效果，為布魯氏菌DNA疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株及質(zhì)粒

B.abortus2308滅活菌株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所惠贈；DH5α，BL21(DE3)菌株購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒pET32a，pcDNA3.1和293T人胚腎細胞由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳清民教授惠贈；BALB/C小鼠，由河北科技師范學(xué)院動物傳染病實驗室自繁自養(yǎng)。

1.2 主要試劑

Ni-瓊脂糖凝膠，His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體和HRP-羊抗鼠IgG，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；ConA，DMSO，MTT，紅細胞裂解液，SDS-PAGE 及Western blot相關(guān)試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 重組表達載體和表達菌株的構(gòu)建

提取B.abortus2308基因組DNA，通過PCR獲得L7/L12和GroES的融合基因片段。引物信息見表1，其中引物L(fēng)G-1～LG-4(重疊PCR技術(shù))用于構(gòu)建原核表達載體，引物L(fēng)G-5～LG-8(重疊PCR技術(shù))用于構(gòu)建真核表達載體。

分別進行PCR和重疊PCR擴增，擴增產(chǎn)物與質(zhì)粒pET32a，pcDNA3.1進行雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化，涂布Amp平板培養(yǎng)過夜。挑取單菌落使用相應(yīng)引物(T7和S-tag引物，pcDNA3.1-F和pcDNA3.1-R)進行PCR鑒定，陽性菌株提取質(zhì)粒、雙酶切鑒定，送生工測序。鑒定無誤的重組質(zhì)粒分別命名為pET32a-LG和pcDNA3.1-LG。

表1 引物信息

1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達、驗證及純化

將重組質(zhì)粒pET32a-LG轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達后，進行SDS-PAGE和Western blot分析，驗證其表達。

誘導(dǎo)表達后，超聲裂解菌體，離心分離上清和沉淀，分別進行SDS-PAGE，對表達產(chǎn)物形式進行分析；對表達產(chǎn)物進行Ni柱純化，并進行SDS-PAGE驗證。

1.5 重組蛋白的鼠源多克隆抗體的制備及鑒定

首次免疫使用弗氏完全佐劑乳化重組蛋白，在小鼠背部皮下多點注射免疫小鼠，劑量為100 μɡ/只，2周后二免，使用弗氏不完全佐劑乳化蛋白，劑量為50 μɡ/只；1周后三免，方法同二免；1周后加強免疫，不使用佐劑，劑量為100 μɡ/只，腹腔注射；1周后禁食1 d，次日取血、分離血清。取重組蛋白進行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)膜，使用制備的鼠血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體作為二抗進行Western blot分析。

選擇蛋白濃度100 ng/孔包被培養(yǎng)板，對血清進行倍比稀釋，二抗使用1∶5 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，測定血清抗體滴度。

1.6 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LG的瞬時轉(zhuǎn)染

采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染的前1 d，在2塊6孔培養(yǎng)板中接種2 mL 293T細胞于單孔中，每孔約2×105個細胞，使轉(zhuǎn)染當(dāng)天細胞融合度能夠達到50%～80%。在1.5 mL離心管中將2 μɡ的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒溶于200 μL jetPRIME?buffer，旋渦震蕩10 s；然后加入 4 μL jetPRIME?reagent，旋渦震蕩10 s，室溫孵育10 min；然后將細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基棄去，添加無血清培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物輕柔加入到單孔培養(yǎng)基中，充分混勻，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基，換為血清體積分數(shù)為10%的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取其中一塊6孔板進行間接免疫熒光；另一塊6孔板培養(yǎng)48 h后，收集293T細胞用于Western blot檢測。

1.7 真核表達產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定

取轉(zhuǎn)染后的293T 細胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3遍；20 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，用PBS洗滌3遍；10 g/L Triton X-100，室溫下作用15 min，用PBS洗滌3次；20 g/L BSA，4 ℃封閉過夜，PBS洗滌3遍；使用pET32a-LG和pcDNA3.1-LG抗血清，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次；加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37 ℃避光孵育1 h；PBS洗滌6次，加入PBST 1 mL，熒光顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.8 真核表達產(chǎn)物的Western blot鑒定

取出轉(zhuǎn)染的細胞置于冰上，用冰冷的PBS洗滌3次，加入蛋白上樣緩沖液，收獲細胞至1.5 mL EP管中，煮沸15 min；4 ℃，14 000 r/min離心10 min，取上清即為蛋白樣品，western blot分析表達情況。

1.9 動物免疫

將BALB/c小鼠分為3組，每組5只，前兩組分別免疫重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒，劑量為100 μg/只，免疫方式為腿部肌肉注射；對照組肌注等體積PBS。首次免疫后，在1周和2周時加強免疫，劑量和方法同首次免疫。首次免疫后每間隔7 d，隨機取3只小鼠采血，收集血清，-20 ℃保存，共采血3次。每次采血后，處死小鼠，分離脾細胞，進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。

1.10 血清抗體滴度檢測

采取間接ELISA法對血清抗體滴度進行檢測，以純化后的pET32a-LG和pcDNA3.1-LG重組蛋白為抗原(200 ng/孔)進行包被，小鼠血清為一抗(稀釋倍數(shù)為1∶50)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗(稀釋倍數(shù)1∶5 000)，測定OD450。

1.11 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗

取處死小鼠脾臟，制備脾細胞懸液，注意使用紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗滌后，使用細胞培養(yǎng)基重懸細胞。細胞以105/孔鋪96孔板，每只小鼠脾細胞鋪9孔，其中1～3孔加入11 μL純化透析處理的LG重組蛋白(5 μg/mL)，4～6孔加入11 μL 細胞培養(yǎng)液，作為未刺激組；7～9孔ConA稀釋到5 μg/mL加入11 μL，作為ConA刺激組；另往10～12孔加入11 μL 1640培養(yǎng)液，作為無細胞對照組。作用72 h后，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后往孔中加入Formazan溶解液，混勻后培養(yǎng)4 h，測定OD570。計算刺激指數(shù)=(試驗組OD570均值-無細胞對照組的OD570均值)/(未刺激組的OD570均值-無細胞對照組的OD570均值)。

1: L7/L12-GroES; 2:GroES; 3: L7/L12; M: DL2000 Plus DNA Marker圖1 L7/L12和GroES基因PCR擴增

2 結(jié) 果

2.1 LG基因的PCR擴增

用牛種布魯氏菌2308基因組DNA為模板，通過PCR獲得L7/L12和GroES融合基因片段，實驗結(jié)果表明，成功連接L7/L12和GroES兩基因(圖1)。

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達、驗證和純化

將重組質(zhì)粒pET32a-LG轉(zhuǎn)化表達菌株BL21后誘導(dǎo)表達后SDS-PAGE，條帶大小符合預(yù)期(圖2A)。為了進一步驗證分泌蛋白表達，對融合蛋白進行針對表達標(biāo)簽His的Western blot鑒定，進一步證明目的蛋白獲得了表達(圖2B)。

對蛋白表達形式進行分析，實驗結(jié)果表明，重組蛋白主要為包涵體表達(圖2C)。對表達產(chǎn)物進行包涵體表達純化，并進行蛋白垂直電泳分析，得到了純度較高的融合表達蛋白(圖2D)。

2.3 多克隆抗體的Western blot驗證

小鼠眼球采血后離心收集血清，將分離到的血清作為一抗，LG原核蛋白作為抗原進行Western blot驗證。結(jié)果表明，多抗制備成功(圖3)。經(jīng)過ELISA測定，血清稀釋度1∶15 000時，P/N值仍大于2.1，因此確定該血清的抗體效價為15 000。

2.4 間接免疫熒光檢測pcDNA3.1-LG在293T細胞中的表達

利用鼠源性pET32a-LG蛋白的多抗，對用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細胞24 h后進行免疫熒光檢測。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LG重組質(zhì)粒的293T 細胞中，可以看到特異綠色熒光，可見pcDNA3.1-LG重組質(zhì)粒能在293T 細胞中獲得表達(圖4)。

2.5 Western blot分析pcDNA3.1-LG在293T細胞中的表達

Western blot分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LG的293T細胞中，可以檢測到大小約為48 ku的蛋白質(zhì)條帶；而在轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的293T細胞中，未檢測到相應(yīng)的目的條帶(圖5)。

A：SDS-PAGE分析； B：Western blot驗證； C：表達形式分析； D：蛋白純化圖2 重組蛋白表達與純化

LG：pET32a-LG；空載：pET32a 圖4 間接免疫熒光驗證蛋白在 圖3 多抗的制備及驗證 93T細胞中的表達

2.6 免疫效果評價

2.6.1小鼠血清抗體水平檢測 采用ELISA方法對免疫后的小鼠進行血清抗體檢測，結(jié)果顯示，免疫重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LG后的抗體水平高于空質(zhì)粒組和PBS組(圖6)。

2.6.2淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 利用MTT法對脾細胞進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗，測定OD570，計算刺激指數(shù)，以試驗組刺激指數(shù)/未刺激組刺激指數(shù)為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)作圖。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LG免疫組的刺激指數(shù)高于未刺激組和空質(zhì)粒組(圖7)。

LG:pcDNA3.1-LG；空載：pcDNA3.1 圖5 Western blot驗證蛋白在293T細胞中的表達 圖6 ELISA方法測定免疫小鼠血清抗體水平 圖7 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗測定細胞免疫水平(MTT法)

3 討 論

布魯氏菌病是世界上流行最為廣泛和危害最為嚴重的人畜共患疾病之一，最為有效的防控手段為疫苗免疫[6,10～12]。最廣泛使用的疫苗是減毒疫苗，盡管它的使用在布魯氏菌病的預(yù)防和治療中起著重要作用，但這些疫苗存在一些明顯的缺點，例如安全性不足、有排毒性風(fēng)險、對人具有致病性等[3,5,13]。大量研究證明，DNA疫苗能夠引起良好的體液和細胞免疫，為布魯氏菌疫苗開發(fā)提供了重要思路和方向[4,7,14,15]。

本次研究利用真核載體pcDNA3.1構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞驗證重組蛋白的表達，并免疫動物后測定體液和細胞免疫水平，結(jié)果顯示該重組質(zhì)粒具有良好的免疫效果。

布魯氏菌Cu/Zn SOD是較早被研究用于DNA疫苗的靶點基因，取得了一定的免疫保護效果。隨著研究深入，大量的靶基因被用于布魯氏菌DNA疫苗的構(gòu)建，例如BSP31，L7/L12，BvrR，GroES等基因[14,16～18]。由于單一基因構(gòu)建的DNA疫苗免疫保護力不足，本次研究選擇L7/L12和GroES進行融合表在載體構(gòu)建，并轉(zhuǎn)染細胞，驗證其表達，以期獲得更好的免疫力。

經(jīng)典觀點認為布魯氏菌的特異性抗體不能幫助機體抵御該菌感染，但近年來的研究顯示，機體產(chǎn)生的某些抗體對該菌具有明顯的調(diào)理作用，因此，核酸疫苗刺激機體產(chǎn)生的抗體水平在一定程度上顯示其免疫保護力[19]。本次研究中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LG能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，可能參與機體對布魯氏菌的抵御作用。同時，利用淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗證明，該重組質(zhì)粒能夠刺激機體產(chǎn)生良好的細胞免疫力。

綜上所述，本次研究構(gòu)建了L7/L12和GroES的融合表達真核質(zhì)粒，免疫小鼠后，機體產(chǎn)生了良好的體液和細胞免疫力。