栗果草酸青霉菌的室內最適培養條件

蘭淑慧，溫曉蕾,3，馮麗娜，霍佳歡何新月，孫偉明*，齊慧霞*

(1 板栗產業技術教育部工程研究中心，河北 秦皇島，066004；2 河北科技師范學院農學與生物科技學院，河北省特色園藝種質挖掘與創新利用重點實驗室；3 河北農業大學植物保護學院)

隨著板栗(CastaneamollissimaBlume)產量的提高，板栗貯藏期的病害逐年加重[1]。其中，栗實腐爛病危害日漸凸顯，果實腐爛率最高達到40%～50%[2]，嚴重威脅著板栗產業的發展。關于栗實貯藏期腐爛病發生原因的研究較多，普遍認為是由致病微生物侵染引起，常見的致腐微生物有鏈格孢屬(Alternariaalternata)、聚端孢屬(Trichotheciumsp.)、殼梭孢屬(Fusicoccumsp.)、小穴殼屬(Dothiorellasp. )、絲核菌屬(Rhizoctoniasp.)、青霉菌屬(Penicilliumsp.)、鐮孢菌屬(Fusariumsp.)等[3～6]。其中，青霉菌屬廣泛分布于我國南北各產區腐爛栗實中[6]，小刺青霉、擴展青霉等均已報道能夠侵染板栗果實[7，8]，但關于草酸青霉致病力的研究相對較少，相關報道主要圍繞草酸青霉在纖維素降解、發酵生產、生物防治等方面的應用效果而展開[9，10]。筆者對引起栗果腐爛的草酸青霉菌的最適生長條件進行了室內試驗，以期明確環境因子對菌絲生長及產孢的影響，為板栗采后貯藏及相關病害防治提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2019～2020年在河北科技師范學院植物保護實驗室進行。

栗果草酸青霉(Penicilliumoxalate)由河北科技師范學院植物保護實驗室提供。

PDA培養基：馬鈴薯200 g·L-1,葡萄糖20 g·L-1,瓊脂20 g·L-1,自然pH，蒸餾水1 000 mL。

察氏培養基：NaNO33 g·L-1，K2HPO41 g·L-1，MgSO40.5 g·L-1，KCl 0.5 g·L-1，FeSO40.01 g·L-1，蔗糖30 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1不同培養基對菌絲生長和產孢的影響 選用燕麥馬鈴薯培養基[11]、綠豆培養基[12]、玉米汁培養基[13]、板栗培養基[14]、胡蘿卜培養基[15]、肉汁胨培養基[16]、沙堡弱培養基[17]共7種，即7個處理。用5 mm的打孔器從菌落邊緣取菌餅，將菌餅放置于培平板的中央位置，做好標記，每個處理3次重復，置于25 ℃恒溫全黑暗培養箱中培養。用十字交叉法連續測定10 d菌落直徑。同樣方法培養7 d后，使用血球計數板在顯微鏡下測定菌落產孢的情況。

1.2.2不同溫度對菌絲生長和產孢的影響 將直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養基中，設置溫度從5 ℃開始，每5 ℃為一個溫度梯度，35 ℃為試驗終止溫度，共計7個溫度梯度，每個處理3次重復。培養及測定方法同1.2.1。

1.2.3不同光照對菌絲生長和產孢的影響 將直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養基，將培養箱分別設置全光照、全黑暗和光暗交替共3個處理，25 ℃恒溫培養，每個處理3次重復。菌落直徑的測量和產孢量的測定方法同1.2.1。

1.2.4不同pH對菌絲生長和產孢的影響 用1 mol·L-1HCl和1 mol·L-1NaOH將PDA培養基的pH分別調節至5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0和11.0共計7個處理，將直徑5 mm的菌餅接種于PDA培養基中，每個處理3次重復，培養及測定方法同1.2.1。

1.2.5不同氮源對菌絲生長和產孢的影響 以察氏培養基為基礎，分別以相同含氮量的NH4Cl,牛肉膏，(NH4)2SO4，蛋白胨，酵母浸粉和KNO3置換其中的NaNO3制成7種不同的培養基，接種直徑為5 mm的菌種，每個處理3次重復，培養及測定方法同1.2.1。

1.2.6不同碳源對菌絲生長和產孢的影響 以察氏培養基為基礎培養基，分別以相同含碳量的麥芽糖、果糖、乳糖、木糖醇、葡萄糖、可溶性淀粉置換其中的蔗糖，制成7種不同的培養基，接種直徑為5 mm的菌種，每個處理3次重復，培養及測定方法同1.2.1。

1.2.7通氣狀況對菌絲干質量的影響 以PDA液體培養基為基礎培養基，將純化后的菌種用直徑5 mm的打孔器在菌落的邊緣打成菌餅在超凈工作臺中移入250 mL的錐形瓶中，每個錐形瓶分裝100 mL培養基。搖床分別設置為連續震蕩、完全靜止、間歇震蕩(12 h震蕩+12 h靜止)共計3個處理，每個處理3次重復，培養5 d后用烘干箱烘干至恒質量，測定菌絲干質量。

表1 培養基對草酸青霉菌菌絲生長和產孢的影響

2 結果與分析

2.1 不同培養基對菌絲生長和產孢的影響

栗果草酸青霉菌在7種培養基上均可生長和產孢(表1)，在燕麥馬鈴薯培養基上菌絲生長最快且產孢最多，10 d菌落直徑為8.50 cm(圖1)，7 d產孢量達到了4.93×107個/皿；板栗培養基及胡蘿卜培養基對菌絲生長的影響無明顯差異；胡蘿卜培養基及沙堡弱培養基對產孢量的影響無明顯差異；菌絲在沙堡弱培養基中生長緩慢，平均菌落直徑為3.45 cm，在板栗培養基上的產孢數量最少，為0.4×107個/皿。

注：A，板栗培養基； B，胡蘿卜培養基； C，綠豆培養基； D，肉汁胨培養基； E，沙堡弱培養基； F，燕麥+馬鈴薯培養基； G，玉米汁培養基圖1 不同培養基對草酸青霉菌菌絲生長的影響

2.2 溫度對菌絲生長和產孢的影響

栗果草酸青霉菌在5～35 ℃均可生長(表2)。30 ℃時板栗草酸青霉菌菌絲生長最快產孢量最多，10 d菌落直徑為4.28 cm，7 d時的產孢量為3.03×107個/皿；產孢量在25，30 ℃培養時無明顯差異，在20，35 ℃培養時產孢量無明顯差異；菌絲在5 ℃時菌落生長最慢，10 d菌落直徑為0.97 cm，7 d產孢量最少，為0.40×107個/皿。

2.3 光照對菌絲生長和產孢的影響

栗果草酸青霉菌在3種光照條件下均可生長和產孢(表3)。在全黑暗條件有利于菌絲生長及產孢，10 d菌落直徑達到了3.0 cm(圖2)，7 d時產孢量5.50×107個/皿；菌絲在全光照條件下生長最慢，光暗交替時產孢最少；菌絲生長及產孢量在各處理間均存在顯著差異。

2.4 pH對菌絲生長和產孢的影響

栗果草酸青霉菌在pH 5.0～11.0時均可生長產孢(表4)。菌絲生長的最適pH為7.0，10 d時菌落直徑為5.98 cm(圖3)；最適產孢的pH為8.0，7 d時產孢量為3.83×107個/皿；菌絲在pH為8.0和9.0的培養基上生長時無顯著差異；pH為5.0，9.0的培養基對產孢量的影響無顯著差異；pH為11.0時不利于菌絲生長及產孢。

表3 光照對草酸青霉菌菌絲生長和產孢的影響

注：A，全黑暗；B，光暗交替；C，全光照圖2 光照對草酸青霉菌菌絲生長的影響

表2 溫度對草酸青霉菌菌絲生長和產孢的影響

表4 pH對草酸青霉菌菌絲生長和產孢的影響

注：A，pH 5.0; B，pH 6.0; C，pH 7.0; D，pH 8.0; E，pH 9.0; F，pH 10.0; G，pH 11.0圖3 pH對草酸青霉菌絲生長的影響

2.5 不同氮源對菌絲生長和產孢的影響

表5 不同氮源對草酸青霉菌菌絲生長和產孢的影響

在7種氮源中，板栗草酸青霉對牛肉膏及酵母浸粉的利用率最高(表5)，以牛肉膏為基礎氮源的培養基最適宜菌絲生長，10 d時菌落直徑為8.50 cm(圖4)；以酵母浸粉為基礎氮源的培養基最適宜產孢，7 d時的產孢量為2.30×107個/皿；菌絲在以NH4Cl和(NH4)2SO4為氮源的培養基上生長情況無顯著差異；在牛肉膏及蛋白胨為氮源的兩培養基上的產孢量無顯著差異；7種氮源中，NH4Cl為氮源最不利于菌絲生長，(NH4)2SO4為氮源最不利于產孢。

注：A，蛋白胨；B，酵母浸粉；C，(NH4)2SO4；D，NH4Cl；E，牛肉膏；F，KNO3；G，NaNO3圖4 不同氮源對草酸青霉菌菌絲生長的影響

表6 不同碳源對草酸青霉菌菌絲生長和產孢的影響

2.6 不同碳源對菌絲生長和產孢的影響

栗果草酸青霉菌在7種不同碳源的培養基上均可生長產孢(表6)。以可溶性淀粉為基礎碳源的培養基最適宜菌絲生長且產孢量最多，10 d時菌落直徑為6.15 cm(圖5)，7 d時產孢量為3.35×107個/皿；以乳糖為基礎碳源的培養基最不利于菌絲生長；以果糖為基礎碳源的培養基產孢量最少。

注：A，可溶性淀粉;B，麥芽糖;C，果糖;D，木糖醇;E，乳糖;F，蔗糖;G，葡萄糖圖5 不同碳源對草酸青霉菌菌絲生長的影響

圖6 各處理菌絲干質量5%顯著水平差異分析

2.7 通氣狀況對菌絲干質量的影響

不同通氣狀況對栗果草酸青霉菌菌絲干質量影響較大，在間歇震蕩下菌絲干質量最大，為0.35 g；連續震蕩下菌絲干質量次之；完全靜止下菌絲干質量為最低值0.13 g(圖6)。

3 結論與討論

本次試驗結合菌絲生長量及產孢量2個標準來衡量草酸青霉菌適宜的培養條件。試驗結果表明：板栗草酸青霉菌菌絲生長及產孢最適宜的培養基為燕麥馬鈴薯培養基；培養溫度為30 ℃時最有利于菌絲生長及產孢，與杜奕君等[18]得出的草酸青霉最適宜的產孢溫度為30 ℃的結果一致；全黑暗時最有利于菌絲生長及產孢，說明黑暗刺激有利于草酸青霉菌絲生長及產孢；12 h震蕩+12 h靜止循環培養條件最有利于草酸青霉菌絲生長，培養5 d后菌落干質量達0.35 g；最適宜草酸青霉菌菌絲生長的pH為7.0，與王俊鳳等[7]所得出的小刺青霉菌最適宜pH為7的結論一致，說明草酸青霉及小刺青霉對酸堿環境要求一致。

氮源對草酸青霉菌菌絲生長影響較大，最有利于菌絲生長的氮源為牛肉膏，與郜海燕等[19]及丁仁惠等[20]有利于波蘭青霉、擴展青霉、指狀青霉及意大利青霉菌絲生長的氮源為蛋白胨的結論有所不同；以可溶性淀粉為基礎碳源的培養基同時適合草酸青霉菌菌絲生長及產孢，與郜海燕等[19]最適合擴展青霉菌絲生長的碳源為可溶性淀粉的結論一致，說明擴展青霉與草酸青霉對碳源的要求一致。與王俊鳳等[7]所得出最適宜菌絲生長和產孢的碳源分別為可溶性淀粉和甘露醇的結論有所不同。本次研究明確了板栗草酸青霉菌對環境和營養條件的需求，但其防控技術還需進一步研究。