從雄激素受體及其活化因子角度探討多囊飲對多囊卵巢模型大鼠卵泡發(fā)育及子宮內(nèi)膜容受性的影響

鄭冬雪 劉軍蓮 馬 蘭 劉詠梅 劉新敏

（1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053；2.中國航天員科研訓(xùn)練中心，北京 100094）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是育齡期女性常見的生殖內(nèi)分泌-代謝紊亂性疾病，臨床表現(xiàn)涉及多毛、痤瘡、脫發(fā)、肥胖等諸多方面，具有高度異質(zhì)性[1]，育齡早期多并發(fā)不良妊娠結(jié)局如妊娠糖尿病、糖耐量降低、高脂血癥等，遠(yuǎn)期則表現(xiàn)為子宮內(nèi)膜癌、2型糖尿病、心血管疾病、代謝綜合征等代謝異常相關(guān)疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)增加[1]。PCOS引起的稀發(fā)排卵、閉經(jīng)、不孕是患者就診的主要原因，因此提高排卵率和受孕率是治療PCOS不孕急需解決的關(guān)鍵問題[1]。克羅米芬、來曲唑是常用的促排卵藥物，但二者均存在受孕率低、流產(chǎn)率高的缺點(diǎn)[2-3]。

多囊飲是名老中醫(yī)李光榮的經(jīng)驗(yàn)方，前期研究表明該方能降低腎虛肝郁型PCOS患者血清睪酮（T）、黃體生成素（LH）水平，促進(jìn)患者恢復(fù)自主月經(jīng)、排卵和受孕，提高妊娠成功率[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該方能降低多囊卵巢（PCO）模型大鼠血清T、LH、胰島素（INS）水平[5]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，通過注射丙酸睪酮建立PCO大鼠模型，研究多囊飲對PCO模型大鼠血清激素、子宮內(nèi)膜組織雄激素受體（AR）及輔助活化因子、妊娠率及胚胎著床情況的影響，探討多囊飲改善雄激素致不孕PCO模型大鼠卵泡發(fā)育及子宮內(nèi)膜容受性的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級7日齡雌性SD大鼠225只，體質(zhì)量180～200 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號：SCXK（京）2006-0009。大鼠使用消毒飼料喂養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號：SYXK（京）2009-0034。

1.2 藥品與試劑 多囊飲浸膏（主要組成藥物：柴胡10 g、白芍12 g、龍膽草6 g、澤蘭12 g、菟絲子30 g、淫羊藿30 g）由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院中藥新藥制劑研發(fā)中心按流程煎制、濃縮，制成浸膏（每克浸膏含生藥量1.73 g），4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩１岵G酮注射液（25 mg/mL，批號：100602），上海通用藥業(yè)股份有限公司；枸櫞酸氯米芬片（50 mg/片，批號：D0703），高特制藥有限公司；Fermentas K1622 RT逆 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒（批 號：00044977），MBI公 司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（批號：1108401），美國應(yīng)用生物公司；Bradford蛋白濃度測定試劑（批號：PA102），北京天根生化科技有限公司；苯甲基磺酰氟（PMSF）、過硫酸銨（APS），美國Amersco公司，批號分別為7626、0172；甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸鈉（SDS），美國Sigma公司，批號分別為034H1130、013K0003、49H0881；三氨基甲烷、丙烯酰胺、甘氨酸，美國Novon公司，批號分別為1582943、1259344、1346281。

1.3 主要儀器 7900HT型熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物公司；Thermo NanoDrop 2000分光光度計(jì)，基因有限公司；高速冷凍離心機(jī)，HITACHI公司；光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；JY99-ⅢB型超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝科器研究所；5415R型高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Lambdal P40紫外可見光分光光度儀，美國PE公司；Mini-ROTEAN3電泳系統(tǒng)與Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；TS-1型脫色搖床，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 所有大鼠予普通食水適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為造模組180只，正常組45只。造模組大鼠參照文獻(xiàn)[6]制作雄激素致不孕PCO大鼠模型，于頸背部一次性皮下注射丙酸睪酮注射液

1.25 mg/只，正常組同時(shí)注射同等劑量的溶劑中性茶油。造模組大鼠待70日齡陰道開口后，連續(xù)觀察陰道上皮細(xì)胞涂片兩個(gè)性周期（每個(gè)性周期5 d，共10 d），陰道上皮細(xì)胞持續(xù)角化，提示造模成功。

2.2 給藥 造模成功后，將造模組大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性藥物組（枸櫞酸氯米芬片每日100 mg/kg）、多囊飲大劑量組（多囊飲每日68.66 g/kg）、多囊飲小劑量組（多囊飲每日34.33 g/kg）。多囊飲各劑量組每日分別按規(guī)定劑量灌胃，連續(xù)給藥10 d；陽性藥物組參照人的用藥方法，每個(gè)動(dòng)情周期灌胃給藥2 d，余3 d予等體積生理鹽水，共給藥2個(gè)動(dòng)情周期；模型組和正常組以等體積的生理鹽水灌胃，連續(xù)10 d。

2.3 取材 于開始灌胃給藥或生理鹽水后的第11天，各組隨機(jī)取15只大鼠，腹股溝靜脈叢取血，分離血清后-80℃冰箱保存。隨后處死大鼠，取出子宮組織，去除周圍脂層，-80℃冰箱保存。剩余大鼠按雌雄比例4∶1合籠，次晨檢查陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓記為D1，此后依天數(shù)類推。將每組大鼠再進(jìn)一步分為D5（子宮內(nèi)膜植入窗期）、D10、D16 共3個(gè)小組，分別于D5、D10、D16斷頸處死，打開腹腔，取雙角子宮。

2.4 檢測指標(biāo)

2.4.1 血清T、卵泡刺激素（FSH）水平 按照說明書采用酶免法分別測定各組15只大鼠血清T、FSH含量。

2.4.2 子宮內(nèi)膜組織AR及輔助活化因子雄激素受體相關(guān)蛋白70（ARA70）、SRC羧基末端激酶結(jié)合蛋白（CBP）、可溶性補(bǔ)體受體1型（SCR1）mRNA表達(dá) 采用RT-PCR檢測。使用trizol法提取總RNA，檢測其純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄cDNA后擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸35 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。實(shí)驗(yàn)中同步進(jìn)行內(nèi)對照GAPDH的定量檢測，以目的基因與GAPDH熒光閾值（Ct）之間比作為目的基因的相對表達(dá)量。以GAPDH為內(nèi)參基因，相對表達(dá)量為2-ΔΔCt，計(jì)算mRNA的相對表達(dá)量。

2.4.3 各組大鼠D5、D10、D16妊娠、胚胎情況 于不同時(shí)期取各組大鼠子宮，記錄妊娠大鼠數(shù)量、著床胚胎數(shù)量或胎兒數(shù)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用（±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（Q25，Q75）]描述，組間比較用非參數(shù)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠血清T、FSH水平比較 與正常組比較，模型組大鼠血清T水平顯著升高（P＜0.01），F(xiàn)SH水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清T水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），多囊飲大劑量組血清FSH水平顯著升高（P＜0.05）。與陽性藥物組比較，多囊飲大、小劑量組大鼠血清T水平均有降低趨勢，F(xiàn)SH水平有升高趨勢，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；多囊飲大、小劑量組組間比較，血清FSH、T水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清T、FSH水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清T、FSH水平比較（±s）

注： 與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。正常組、陽性藥物組分別有2只、1只大鼠血清未檢測出數(shù)據(jù)。

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3.2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織AR基因及輔助活化因子ARA70、CBP、SCR1 mRNA表達(dá)比較 與正常組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織AR、CBP基因表達(dá)顯著升高（P＜0.05），ARA70、SCR1 基因表達(dá)有升高趨勢；與模型組比較，陽性藥物組、多囊飲大劑量組大鼠子宮內(nèi)膜組織AR、ARA70、CBP、SCR1基因表達(dá)均顯著降低（P＜0.01），多囊飲小劑量組大鼠子宮內(nèi)膜組織CBP基因表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與陽性藥物組比較，多囊飲各劑量組大鼠子宮內(nèi)膜組織上述基因表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；多囊飲大劑量組ARA70 基因表達(dá)顯著低于多囊飲小劑量組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織AR基因及輔助活化因子ARA70、CBP、SCR1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織AR基因及輔助活化因子ARA70、CBP、SCR1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注： 與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與多囊飲小劑量組比較，*P＜0.05。表格中動(dòng)物數(shù)為各組實(shí)際檢測出指標(biāo)數(shù)據(jù)的動(dòng)物只數(shù)，各組均有部分大鼠指標(biāo)數(shù)據(jù)未檢出。

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3.3 各組大鼠各時(shí)期妊娠、胚胎情況比較 結(jié)果見表3。D5 各組大鼠均未見胚胎著床。與正常組比較，模型組大鼠D10、D16 妊娠率顯著降低（P＜0.01）；各給藥組大鼠D10、D16 妊娠率與模型組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；D10陽性藥物組和多囊飲大劑量組著床胚胎數(shù)略多于模型組，且多囊飲大劑量組胚胎大小均勻；D16多囊飲大劑量組胎兒數(shù)量略多于模型組、陽性藥物組和多囊飲小劑量組。

表3 各組大鼠D5、D10、D16妊娠及胚胎情況比較（±s）

表3 各組大鼠D5、D10、D16妊娠及胚胎情況比較（±s）

注：與正常組比較，△△P＜0.01。

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4 討論

4.1 多囊飲立法、組方與用藥特色 多囊飲由我國著名中醫(yī)婦科專家李光榮教授創(chuàng)立，具有補(bǔ)腎調(diào)肝、健脾活血、調(diào)經(jīng)助孕的作用，主治腎虛肝郁型PCOS。方中柴胡味苦、辛，性微寒，歸肝、膽經(jīng)，具有和解少陽、疏肝解郁的作用，可疏肝理氣開郁結(jié)，引諸藥入肝經(jīng)，又能升發(fā)陽氣，俾春氣生而萬物化育；白芍味苦、酸，性微寒，歸肝、脾經(jīng)，具有養(yǎng)血斂陰、平抑肝陽的作用。二者為君藥，共奏調(diào)肝解郁、滋陰養(yǎng)血之效。龍膽草清肝火，除肝濕，利肝經(jīng)，使方藥補(bǔ)而不過滋膩，且引肝火下行而不上擾髓海；菟絲子味辛、甘，性平，歸腎、肝、脾經(jīng)，有養(yǎng)肝、補(bǔ)腎、益精的作用；淫羊藿味辛、甘，性溫，歸腎、肝經(jīng)，可補(bǔ)腎壯陽；澤蘭味苦，性微溫，歸肝、脾經(jīng)，可活血、行水、化瘀。諸藥合用，補(bǔ)腎調(diào)肝、健脾活血、調(diào)經(jīng)助孕。

4.2 多囊飲可降低雄激素致不孕PCO模型大鼠血清T水平、升高血清FSH水平 過多的雄激素在卵巢中能抑制卵泡發(fā)育，引起卵泡閉鎖，阻礙優(yōu)勢卵泡的形成和排卵，還能導(dǎo)致卵細(xì)胞質(zhì)量下降[7-8]；同時(shí)會(huì)使得子宮內(nèi)膜腺上皮AR表達(dá)增高，造成子宮內(nèi)膜容受性下降、受精率及受孕率降低[8-9]。降低血清T水平有利于促使卵巢恢復(fù)排卵，提升卵細(xì)胞質(zhì)量及子宮內(nèi)膜容受性。

研究表明，若FSH水平較低，則不能充分將雄激素芳香化為雌激素，卵泡局部雄激素較多，雌激素較少，以致卵泡不能發(fā)育成熟，呈長期無排卵狀態(tài)。PCOS患者卵泡募集數(shù)量較多，卵泡的選擇及優(yōu)勢化停止，多個(gè)發(fā)育不全的小卵泡停留在各階段或提前閉鎖，形成多囊性卵巢的形態(tài)，閉鎖的卵泡形成間質(zhì)組織的一部分，使卵巢間質(zhì)變形增生，成為PCOS的特征之一[10-11]。故提高FSH水平可以在一定程度上改善卵泡的發(fā)育情況。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，多囊飲能夠有效降低雄激素致不孕PCO模型大鼠血清T水平，提高FSH水平，說明多囊飲具有調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸的作用，從而可改善排卵情況。

4.3 多囊飲改善子宮內(nèi)膜容受性 PCOS不孕表現(xiàn)為低受孕率和高流產(chǎn)率，其原因?yàn)槁雅莅l(fā)育障礙所導(dǎo)致的無排卵和子宮內(nèi)膜容受性降低，二者均與雄激素增高有關(guān)。雄激素通過與雄激素受體特異性結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，雄激素受體輔助活化因子如SCR、ARA、CBP等可通過蛋白之間的相互作用降低雄激素受體活化對雄激素濃度的要求，在一定程度上有提高雄激素活性的作用。

本研究結(jié)果表明，雄激素致不孕PCO模型大鼠子宮內(nèi)膜組織AR、CBP基因表達(dá)顯著升高，表明丙酸睪酮注射造模的PCO大鼠具有子宮內(nèi)膜局部雄激素受體及其活化因子異常。經(jīng)過多囊飲治療后，PCO模型大鼠子宮內(nèi)膜組織AR、ARA70、CBP、SCR1基因表達(dá)水平有不同程度的降低，且對ARA70的改善多囊飲大劑量組顯著優(yōu)于小劑量組。對大鼠妊娠、胚胎情況的觀察發(fā)現(xiàn)，給予多囊飲灌胃治療后，雄激素致不孕PCO模型大鼠的妊娠率及胚胎、胎兒數(shù)較模型組有改善趨勢，說明中藥可增加PCO大鼠胚胎著床數(shù)量，提高妊娠率。上述結(jié)果說明多囊飲可能通過降低子宮內(nèi)膜局部雄激素及雄激素受體的基因表達(dá)，從而改善子宮內(nèi)膜容受性，且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。雄激素-雄激素受體途徑是多囊飲發(fā)揮促進(jìn)卵泡發(fā)育、改善子宮內(nèi)膜容受性的作用途徑之一。

綜上所述，多囊飲能夠?qū)ο虑鹉X-垂體-卵巢軸的功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，通過調(diào)節(jié)激素水平、改善雄激素-雄激素受體相關(guān)基因表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)卵泡發(fā)育、提高子宮內(nèi)膜容受性的效果，進(jìn)而促使機(jī)體恢復(fù)排卵并提高受孕幾率。課題組擬進(jìn)一步對多囊飲不同劑量的藥物有效成分、治療PCOS的作用機(jī)制、信號通路、靶點(diǎn)進(jìn)行研究，以更嚴(yán)謹(jǐn)、科學(xué)地使用中藥治療疾病。