通體結香技術處理30 d產沉香的品質監測△

何欣，張燕a，孟慧，魏建和，呂菲菲，劉培衛，李浩凌，陳波，黃良明，楊云*

1.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 中草藥物質基礎與資源利用教育部重點實驗室/瀕危藥材繁育國家工程實驗室，北京 100193；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所 海南分所 海南省南藥資源保護與開發重點實驗室/國家中醫藥管理局沉香可持續利用重點研究室，海南 海口 570311

沉香屬（AquilariaLam.）植物是一類具有極高價值的非木材資源類樹種，主要以其受傷害后形成的樹脂而聞名，這種含有芳香樹脂的木材被稱為沉香[1-2]。沉香使用歷史悠久，不僅在中國作為傳統名貴藥材及工藝品使用，還常在中東及歐美地區被作為香料[3-5]。沉香的形成需要受到外界傷害，且需要長時間積累[6]。由于近年來國際市場對沉香的需求越來越大，濫砍、濫伐現象頻生，野生資源再生困難，使沉香自然種群瀕臨滅絕[7-8]。目前，所有的沉香屬及擬沉香屬（Gyrinopsspp.）物種均已被列為瀕危物種[9]。

隨著野生資源的瀕危，現有沉香資源已無法滿足人們的需求。為解決市場高品質沉香短缺問題、更好地保護沉香瀕危野生物種，許多亞洲國家開始大面積種植沉香樹。此外，多種人工誘導技術被開發用于生產沉香。除傳統的砍傷[10]、鉆孔[11]、火烙[12]、打釘[13]等方法外，人工結菌法[14]、栽培沉香試劑盒（CA-kit）法[15]及輸液法通體結香技術（Agar-WIT）[16-17]等也被應用于沉香生產。Agar-WIT 是目前中國及其他產沉香的國家應用最廣泛的人工誘導技術，已應用于中國及東南亞國家超過45 萬株沉香樹[18]。其具體方法為在距地面50 cm高的白木香樹樹干上鉆孔，孔深達木質部，通過輸液裝置將結香液輸入到小孔中，借助樹體的蒸騰作用將安全高效的結香液輸送至植株的各個部位，經6～12 個月處理后，即可在樹干中形成沉香，而后整樹伐倒收集沉香[19]。與自然結香和傳統的人工結香方式相比，該技術具有產量高、成本低、操作簡便的優勢[20-21]。

近年來，Agar-WIT 被廣泛應用于許多國家的沉香生產，本研究通過對Agar-WIT 處理30 d內沉香形成過程進行動態監測，從性狀、顯微結構、浸出物、特征圖譜及沉香四醇含量測定方面分析沉香形成規律，揭示Agar-WIT 運用早期植物體內發生的結構、物質變化規律，將有助于指導沉香的采收和高效生產，并為Agar-WIT 的推廣應用和技術升級提供參考。

1 材料

1.1 樣品

選擇中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所興隆研發基地3 年生白木香，Agar-WIT 處理結香，結香處理第1天起從輸液孔上1 m處每天向下截取厚度為3 cm 的樹段，持續收集結香樣品30 d。每次3株平行取樣設為1 個實驗組，空白對照組為未經任何處理的健康白木香樣品。憑證標本保存于中國醫學科學院藥用植物研究所海南分所沉香鑒定中心標本館。

1.2 儀器

ECLIPSE80i 型生物顯微鏡（日本尼康株式會社）；7890A-5975C 型氣相色譜質譜聯用（GC-MS）儀（美國Agilent 公司）；2695/2475 型高效液相色譜（HPLC）儀［沃特世科技（上海）有限公司］；HH-6 型電熱恒溫水浴鍋（江蘇科技儀器有限公司）；AL104-IC 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；Mili-Q 型純水儀（美國Millipore公司）；CM1950 型冰凍切片機（德國Leica 公司）；SB25-12DTDN 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.3 試藥

沉香四醇對照品（批號：111980-201904，純度：98.6%）、沉香對照藥材（批號：121222-201203）均購于中國食品藥品檢定研究院；乙腈為HPLC級；95%乙醇、無水乙醇、乙醚、水合氯醛等均為分析級；GF254薄層色譜板（批號：HX69349529，德國Merck公司）。

2 方法

2.1 樣品前處理

砍斷的沉香樹段去掉枝葉及外皮，干燥后剪成約0.5 cm 的方形小塊用于后續顯微觀察，另取沉香樹段按海南省地方標準《白木香通體結香樹木剖香技術規程》（DB45/T 257—2013）[22]要求，剖取沉香，剪成香片后打粉，分別過二號篩和三號篩，備用。

結香層認定標準為宏觀上出現黃棕色環形沉香層；顯微觀察到木間韌皮部和射線細胞有黃棕色樹脂[23]；薄層色譜出現與對照藥材對應的條帶。

2.2 沉香結香率計算

結香處理后的沉香樹段截為3 段，每段上切取厚度為1 cm 的莖段。正上方分別拍取3 個莖段下截面橫截面圖，利用Photoshop像素法算出每株樹的橫截面平均像素（NC）和結香區域平均像素（NA），結香層面積（SA）與橫截面面積（SC）之比等于結香區域與橫截面像素數之比。每株樹的結香率按公式（1）計算。

本研究中結香材料皆為胸徑樹齡相似的筆直單桿白木香樹，假設每棵樹的樹干為上下均等的標準圓柱體，且每棵樹樹干的結香率整體保持一致。

2.3 顯微鑒別

將沉香樣品（包含白木層、沉香層和腐爛層）剪成方形小塊，置于包埋盒中，70 ℃熱水浴浸泡6 h 至沉香樣品塊完全軟化。冷凍切片機切取50 μm左右的薄片，放入水合氯醛透化劑中透化8 h，裝片，置于顯微鏡下觀察。

2.4 薄層鑒別

稱取沉香樣品粉末（過二號篩）0.5 g，乙醚30 mL 提取，超聲處理1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷2 mL 溶解，作為供試品溶液。另取沉香對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。參照《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2020年版薄層色譜法（通則0502）[24]，吸取上述2 種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，在三氯甲烷-乙醚（10∶1）條件下展開，取出后晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。

2.5 特征圖譜和沉香四醇含量測定

按照《中國藥典》2020 年版方法[24]測定特征圖譜和沉香四醇含量。

標準曲線繪制：稱取沉香四醇對照品適量，精密稱定，加無水乙醇分別制成質量濃度為0.2、0.4、1.0、2.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μg·mL-1的溶液，再用0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。以峰面積（Y）對沉香四醇質量濃度（X）進行線性回歸，繪制標準曲線。

2.6 GC-MS檢測

樣品溶液制備：稱取沉香粉碎樣品和健康白木香粉碎樣品各0.5 g，置50 mL 錐形瓶中，加入乙醚8 mL 冰浴超聲處理3 次（功率250 W，頻率40 kHz），每次0.5 h，靜置5 min，0.22 μm 微孔濾膜濾過，合并3 次濾液，室溫下揮干，乙醚2 mL 溶解，即得。

GC-MS 條件：色譜柱為HP-5MS 5% Phenyl Silox 毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；初始柱溫60 ℃，保持2 min；4 ℃·min-1升至250 ℃。進樣口溫度240 ℃；載氣為氦氣；流速為1 mL·min-1；分流比為20∶1；溶劑延遲4 min；電子轟擊（EI）離子源溫度為230 ℃；四級桿溫度為150 ℃；接口溫度為260 ℃；質量掃描范圍m/z40～300。

通過MSD 工作站，結合NIST11 標準譜庫對總離子流圖進行分析和檢索，確定沉香提取物各組分成分。

3 結果

3.1 性狀

未經傷害處理的白木香樹橫截面顏色為乳白色。經Agar-WIT 處理30 d，白木香橫截面出現明顯顏色變化（圖1）。由外至內可劃分為白木層、過渡層、沉香層和腐爛層。處理第4～5 天可觀察到1 圈淺棕色的沉香層，且顏色隨處理時間延長而逐漸加深，厚度也隨之增加，處理第9 天可在沉香層內側觀察到腐爛層，且腐爛層在30 d 內逐漸充滿沉香層內部空間，說明Agar-WIT 處理30 d可形成明顯的沉香層結構。

圖1 Agar-WIT處理30 d所產沉香性狀

3.2 結香率

Agar-WIT 處理30 d，沉香的平均結香率為8.04%，總體呈波動上升趨勢。觀察發現處理第4～5 天和第28～30 天時結香率均呈現顯著上升趨勢。其中，第4～5 天的結香率由4.31%急劇上升至8.11%（圖2）。

圖2 Agar-WIT處理30 d所產沉香的結香率（n=3）

3.3 顯微特征

觀察Agar-WIT 處理1～30 d 沉香橫切面顯微特征發現，Agar-WIT 處理第4 天在木間韌皮部和射線細胞中均觀察到有黃棕色樹脂出現，且黃棕色樹脂隨處理時間延長逐漸充滿木間韌皮部，顏色也隨之加深，與性狀觀察結果相符。觀察發現，處理第4天開始產生沉香，處理30 d 可形成明顯的沉香層結構（圖3）。

3.4 沉香的薄層色譜

如圖4 所示，Agar-WIT 處理第1～4 階段沉香樣品的熒光斑點數量隨處理時間延長而隨之增加，結香第3階段和第4階段樣品薄層色譜上的熒光斑點與沉香對照藥材（CK）一致。

3.5 沉香四醇含量測定

處理30 d 所產沉香的沉香四醇質量分數變化見圖5。處理30 d 內沉香四醇質量分數由0.001%增長至0.034%，平均質量分數為0.017%，整體呈顯著上升趨勢。

圖5 Agar-WIT處理30 d所產沉香的沉香四醇質量分數（n=3）

3.6 特征圖譜

處理30 d 內所產沉香的特征圖譜見圖6。其中，S1～S12 為處理第1～4 階段的沉香樣品。隨著處理時間的增加，沉香的6個特征峰逐漸出現，第3階段時所有特征峰均已顯現。Agar-WIT 處理30 d 所產沉香的特征圖譜與CK一致。

圖6 Agar-WIT結香30 d所產沉香的特征圖譜

3.7 氣相色譜主要成分檢識

健康白木香乙醚提取物中含有豐富的脂肪酸和烷烴（表1），而沉香揮發油中則富含倍半萜和芳香類成分[25]。Agar-WIT 處理1～30 d 所產沉香的部分化合物變化見圖7。其中，芳香類成分2,4-二叔丁基苯酚和芐基丙酮分別在處理第1 天和第9 天被檢測到，倍半萜類成分別香橙烯和香橙烯分別在處理第16 天和第20 天被檢測到，α-檀香醇和δ-蛇床烯分別在處理第16天和第26天被檢測到。

圖7 Agar-WIT處理30 d所產沉香部分化學成分變化情況

表1 健康白木香中的成分

4 結果與討論

沉香是植物抵御外界傷害的反應產物，在形成過程中，會使木質部結構發生變化，出現明顯的分層，由內而外根據形態和色澤可分為腐爛層、沉香層、過渡層和白木層[26]。Agar-WIT 處理后第4 天形成環形的沉香層，腐爛層于第9 天顯現于沉香層內側，處理30 d 即可形成明顯的沉香層結構，這說明Agar-WIT 能快速誘導產生沉香類物質。除此以外，沉香在形成過程中木間韌皮部還可生成1 圈屏障層，即在沉香層和過渡層之間存在阻隔層[27]。在本研究中，Agar-WIT 處理30 d 沉香樣品并未見阻隔層，推測可能為傷害時間過短，木間韌皮部的薄壁細胞還未分化形成阻隔層。

健康的白木香主要含有脂肪酸類化合物，不含色酮類、倍半萜類及芐基丙酮類化合物[28]。倍半萜和色酮是沉香類物質的主要成分[29-30]，主要在木間韌皮部、導管和射線細胞中形成和積累[23]。其中，沉香的品質與揮發油類和2-(2-苯乙基)色酮的含量有關，色酮類、倍半萜、芳香族化合物的芐基丙酮則與沉香的形成機制存在一定的相關性[27-28]。Chen等[25]發現，化學法刺激所得沉香和野生沉香的揮發油成分相似，2 種沉香中均含有芐基丙酮、cubenol、愈創醇、eudesm-7(11)-en-4α-ol、α-copaen-11-ol、白木香醛，健康白木香揮發油則含有高達59.65%的棕櫚酸和油酸。本研究發現，健康白木香的乙醚提取物中以棕櫚酸和烷烴類成分為主，未見倍半萜和色酮類成分，這與Chen 等[25]的研究結果基本一致。本研究未從健康白木香中檢測到油酸，可能與提取方法和白木香的生長年限有關。倍半萜類化合物通過甲羥戊酸途徑（MVA）和脫氧木酮糖-5-磷酸途徑（DXP）2 種生物途徑在植物體內合成[31-33]。α-檀香醇等倍半萜在沉香結香30 d 即能被檢測到，推測別香橙烯、香橙烯等倍半萜和芐基丙酮是白木香樹受傷害后的初始合成產物。2,4-二叔丁基苯酚在健康白木香和傷害后的白木香中均可被檢測到，說明2,4-二叔丁基苯酚是健康白木和沉香共有的成分，然而其在傷害過程中的積累和變化還有待研究。本研究中檢測的α-檀香醇、芐基丙酮、δ-蛇床烯、2,4-二叔丁基苯酚等成分均為沉香揮發油的成分[25,34-38]，其中，α-檀香醇具有安定作用[39]，芐基丙酮具有鎮靜、止咳作用[40-41]，這些成分均可在Agar-WIT 處理30 d 的沉香中被檢測到。Agar-WIT 處理1 年的沉香具有鎮靜、安神、止咳方面的作用[42]，說明沉香形成早期的化合物演變具有延續性，但這些化合物在沉香形成階段的變化規律還需進一步研究。

目前，全世界野生沉香資源緊缺，已處于瀕危狀態，而全球對高品質沉香的需求日益增加。因此，高效、穩定的結香技術對沉香產業的發展至關重要。本研究對Agar-WIT處理30 d內沉香形成過程進行了動態監測，揭示了Agar-WIT 運用早期植物體內發生的結構、物質變化規律，表明Agar-WIT 處理30 d能夠促進沉香的快速形成和穩定積累。研究結果不僅為該技術的推廣應用和技術升級提供了數據支撐，也為開發更高效的結香技術提供了參考。對于沉香結香過程中的化學成分變化和積累的規律及相互作用，還需要進一步研究。